武雪亮，王立坤，周海豐，郭 飛，楊永江，劉 博，楊東東*，屈 明，薛 軍

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院 1.普通外科； 2.超聲醫(yī)學(xué)科； 3.病理科， 河北 張家口 075000)

據(jù)2012年全球腫瘤流行病數(shù)據(jù)統(tǒng)計：中國人群的結(jié)直腸癌目前排位死因順位從第7位上升到第5位，男女死亡率分別為9.0/10萬和6.1/10萬，嚴重威脅國民健康[1]。盡管近年來結(jié)直腸癌的普查力度不斷加強，手術(shù)方式不斷改進，靶向藥物大力推廣，并取得了一系列的成就和提高，但結(jié)直腸癌的5年生存率不足60%，仍是公共衛(wèi)生的關(guān)鍵問題，每年造成約608 000例患者死亡[2]。因此，對結(jié)腸直腸癌的深入研究尤對其分子生物學(xué)研究具有很高的臨床價值。

葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白-1(GLUT-1)是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族中最重要的成員，廣泛存在于真核生物和原核生物中，在癌癥發(fā)展階段，包括早期腫瘤生長，癌癥轉(zhuǎn)移和侵襲等方面均具有重要作用。相關(guān)報道證實，在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌等腫瘤細胞內(nèi)均發(fā)現(xiàn)GLUT-l的高表達，GLUT-l的活性和表達水平與腫瘤的惡性生物學(xué)行為密切相關(guān)[3-5]，而GLUT-1在結(jié)直腸癌方面的研究鮮有報道。缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是細胞在低氧條件下產(chǎn)生的一種核轉(zhuǎn)錄因子，在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，扮演著重要的角色，能增強其侵襲性，是近年研究較多的致癌因子。本研究通過對結(jié)直腸癌和癌旁正常結(jié)直腸組織中GLUT-1和HIF-1α行免疫組織化學(xué)染色分析半定量檢測，旨在探討GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達情況及與相關(guān)臨床病理因素間的關(guān)系，為結(jié)直腸癌的靶向診療提供科學(xué)參考。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

收集河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院普通外科2016年9月至2017年1月手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織50例和同期同例癌旁正常結(jié)直腸組織50例，結(jié)直腸的癌組織自癌灶中心處取得，另外取經(jīng)病理證實為正常腸組織的標本切緣。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準，患者知情同意參加本研究。所有病例均為原發(fā)性腫瘤，術(shù)前沒有行針對性治療，如新輔助放化療等，術(shù)后標本均在1 h內(nèi)獲得，并存于液氮中。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗GLUT-l多克隆抗體、鼠抗HIF-1α單克隆抗體購于美國Abcam公司；免疫組化試劑盒、DAB顯色劑購于上海Gene Tech公司。光學(xué)顯微鏡：Nikon Eclipse 50；臺式高速離心機：德國Eppendorf公司；冰凍切片機：北京格美勝達醫(yī)療設(shè)備有限公司；低溫冰柜：青島海爾公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)染色及半定量測定[6]

10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋，切片厚度4 μm，應(yīng)用蘇木精-伊紅染色，行病理診斷。用80℃烤箱對切片進行烘烤30 min，再用乙醇進行脫水，并使內(nèi)源性過氧化物酶滅活，應(yīng)用枸櫞酸緩沖液行高溫高壓水化修復(fù)過程；之后PBS洗3次，加入一抗(1∶100)50 μL，溫度控制于4℃一夜；再用PBS洗3次，加入二抗50 μL。室溫下DAB顯色，PBS洗3次，蘇木精輕度復(fù)染，鹽酸乙醇分化后流動清水沖洗10 min，梯度乙醇脫水，松節(jié)油透明和樹膠行封片處理，PBS代替一抗作為陰性對照，光鏡下觀察。采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行半定量測定，計算單位面積陽性染色積分光密度值，取均值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌、癌旁正常組織中GLUT-1和HIF-1α表達情況

癌組和癌旁正常組織中GLUT-1表達量分別為(2.285±0.459)和(1.086±0.148)，組間差異有顯著性(t=8.919，P< 0.001)；癌組和癌旁正常組織中HIF-1α表達量分別為(2.203±0.401)和(1.055±0.127)，差異有顯著性(t=7.144，P< 0.001)，見圖1、2。

2.2 GLUT-1和HIF-1α表達與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

GLUT-1和HIF-1α的表達量都和腫瘤的浸潤深度、分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤有關(guān)(P< 0.05)。TNM分期高、分化程度低、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤的患者GLUT-1和HIF-1α的表達量均升高，而GLUT-1和HIF-1α的表達量與患者腫瘤大小無相關(guān)性(P> 0.05)，見表1。

注：A1：癌旁正常組織中GLUT-1表達(×200)；A2：結(jié)直腸癌組織中GLUT-1表達(×200)；B1：癌旁正常組織中HIF-1α表達(×200)；B2：結(jié)直腸癌組織中HIF-1α表達(×400)。圖1 癌旁正常結(jié)直腸組織和癌組織中GLUT-1和HIF-1α蛋白的表達(SP法)Note. A1: GLUT-1 expression in normal adjacent tissues(×200); A2: GLUT-1 expression in colorectal carcinoma tissues(×200); B1: HIF-1α expression in normal adjacent tissues(×200); B2: HIF-1α expression in colorectal carcinoma tissues(×400).Figure 1 Expression of GLUT-1 and HIF-1α in human colorectal carcinoma tissues and normal adjacent tissues. Streptavidin-peroxidase (SP) method

注：與癌旁正常組織比較，*P< 0.001。圖2 免疫組化半定量表達檢測分析Note. Compared with the normal adjacent tissues,*P< 0.001.Figure 2 Quantitative immunohistochemical detection and analysis

病理參數(shù)Pathological parametersnGLUT-1表達量GLUT-1 expression levelHIF-1α表達量HIF-1α expression level腫瘤大小(cm) Tumor size≥ 5322.289±0.4032.177±0.395< 5182.080±0.4242.039±0.271分化程度 Differentiation degree高 High122.061±0.1071.950±0.101中 Moderate212.330±0.1722.199±0.117低 Low172.510±0.1032.407±0.095漿膜浸潤 Serosal invasion有 Yes392.452±0.3702.343±0.261無 No112.074±0.2512.015±0.239TNM分期 TNM stageⅠ + Ⅱ81.830±0.4021.801±0.399Ⅲ + Ⅳ422.366±0.4572.254±0.346淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 Lymph node metastasis有 Yes332.431±0.3862.320±0.297無 No172.080±0.2721.971±0.254肝轉(zhuǎn)移 Liver metastasis有 Yes72.477±0.4602.366±0.451無 No431.845±0.4111.831±0.402脈管浸潤 Vascular infiltration有 Yes162.358±0.4112.247±0.405無 No341.996±0.2851.961±0.274

注：除腫瘤大小外，其他各病理參數(shù)不同程度間比較，P< 0.05。

Note. Comparison among different degrees for each pathological parameter except for tumor size,P< 0.05.

2.3 GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中表達的相互關(guān)系

相關(guān)性分析散點圖表明，GLUT-1和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達呈正相關(guān)(r=0.958，P< 0.001)，見圖3。

圖3 GLUT-1和HIF-1α相關(guān)性分析散點圖Figure 3 Scatter plot of correlation analysis of GLUT-1 and HIF-1α

3 討論

結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展是多個基因調(diào)控的多步驟、多因素、多階段的復(fù)雜過程，其中失控性生長和不斷侵襲增殖是惡性腫瘤細胞的最主要特征，這種特征的維系主要靠葡萄糖的無氧酵解為其提供能量，該過程即使在氧充足的環(huán)境下仍可持續(xù)進行[7]。由于腫瘤的高消耗、高代謝，需要較普通細胞成倍的能量。而正常情況下，葡萄糖無法獨立通過細胞膜的雙分子層結(jié)構(gòu)，必須依賴跨膜分布的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白作為載體，因而這類載體的活性及表達量對腫瘤細胞的惡性增殖具有極其重要的意義[8]。

GLUT-1是葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白家族最重要的成員，GLUT-l內(nèi)含492個氨基酸，由12個疏水性的跨膜α螺旋結(jié)構(gòu)域、兩個電荷的膜內(nèi)區(qū)及膜外區(qū)構(gòu)成[9]。Deng等[10]解析的人源GLUT-l的晶體結(jié)構(gòu)顯示其經(jīng)典的協(xié)助轉(zhuǎn)運超家族的折疊方式：12個跨膜螺旋組成NH2-端和-COOH端2個結(jié)構(gòu)域，其中的腔孔呈向胞內(nèi)區(qū)展開，這即是其轉(zhuǎn)運的基礎(chǔ)框架。

腫瘤細胞膜上的GLUT-l的表達受多種途徑調(diào)節(jié)，目前研究較多的有PI3K/AKT/mTOR(磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/雷帕霉素靶蛋白)途徑、HIF-1α(缺氧誘導(dǎo)因子-1α)和p53途徑，PI3K/AKT/mTOR與癌細胞的增殖、微血管形成和轉(zhuǎn)移蛋白的合成關(guān)系密切，且需要大量能量供應(yīng)，在肝癌、胃癌、子宮癌等腫瘤細胞中均證實能上調(diào)GLUT-l的表達[11]。

本研究顯示GLUT-l和HIF-1α在結(jié)直腸癌中的表達量明顯高于在癌旁正常組織，表明在腸黏膜癌變的過程中，細胞膜上的GLUT-l和HIF-1α表達水平不斷上調(diào)，從而確保腫瘤對能量的攝取。進一步研究顯示，GLUT-l和HIF-1α表達量與結(jié)直腸癌的病理分期、浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移和脈管浸潤均明顯相關(guān)，且散點圖分析顯示二者呈明顯正相關(guān)。HIF-1α是調(diào)控癌細胞對缺氧耐受的關(guān)鍵蛋白，研究表明：在肝癌細胞內(nèi)，HIF-1α能直接激活GLUT-l等糖酵解相關(guān)因子活性，從而滿足肝癌細胞的能量攝取，增強其對缺氧的耐受力[12]；在胃腫瘤體外培養(yǎng)的細胞內(nèi)，缺氧條件下應(yīng)用HIF-1α抑制劑處理后，癌細胞內(nèi)活性氧比例更高，凋亡更顯著[13]。國內(nèi)楊通印等[14]對142結(jié)直腸癌組織性免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)GLUT-l和HIF-1α表達明顯高于正常腸黏膜，且二者存在協(xié)同作用，在低氧環(huán)境下，HIF-1α表達上調(diào)能誘導(dǎo)GLUT-l高表達，加速癌細胞糖酵解，促進癌細胞浸潤和轉(zhuǎn)移。

綜上，GLUT-l異常表達對結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展有重要作用，深入探究GLUT-l和HIF-1α的作用機制有望為結(jié)直腸癌精確治療提供重要的理論依據(jù)。