黃志勇，田廣永，曹 玲，詹堅(jiān)宏，趙丹丹，于云紅，周鳳華*

(1.南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，廣州 510630； 2.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，廣州 510515； 3.廣東省人民醫(yī)院中醫(yī)科，廣州 510080)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種與內(nèi)皮損傷、炎癥因子介導(dǎo)、脂質(zhì)沉積浸潤(rùn)有關(guān)的慢性炎癥反應(yīng)[1-2]。雖然AS的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，但內(nèi)皮細(xì)胞損傷是其公認(rèn)的始動(dòng)環(huán)節(jié)。氧化低密度脂蛋白(oxidative low density lipoprotein，ox-LDL)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)、白介素6(IL-6)、白介素8(IL-8)等均可損傷或激活內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞的通透性增加，表面黏附分子如細(xì)胞黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)和E-選擇素等表達(dá)增加，單核細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮黏附分子黏附于損傷內(nèi)皮表面，遷移為巨噬細(xì)胞，從而過(guò)度攝取脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞堆積于血管內(nèi)壁，最終導(dǎo)致AS的發(fā)生[3-5]。

藁本內(nèi)酯(ligustilide，LIG)，又名東當(dāng)歸酞內(nèi)酯，是川芎和當(dāng)歸中主要的內(nèi)酯類化合物，也是其主要的活性成分。LIG在神經(jīng)保護(hù)、抗腫瘤、心腦血管、循環(huán)系統(tǒng)及免疫功能等方面均有較強(qiáng)的藥理作用。有研究表明LIG具有一定的抗AS作用[6]，但其作用機(jī)制并不明確。本課題采用ox-LDL誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)損傷模型，通過(guò)研究LIG對(duì)HUVEC內(nèi)炎性細(xì)胞因子表達(dá)調(diào)控作用，探討LIG保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞及抗AS的藥理機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

第二代人源HUVEC細(xì)胞(批號(hào)ZQ00446，上海中喬新舟科技公司)。

1.2 主要試劑與儀器

藥物：藁本內(nèi)酯(純度> 98%，批號(hào)111737-201608，廣州市藥檢所，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1)用適量二甲基亞砜(DMSO)溶解后，再用PBS稀釋；ox-LDL(批號(hào)YB-002，廣州奕源生物公司)。

圖1 藁本內(nèi)酯化學(xué)結(jié)構(gòu)Figure 1 Structure of ligustilide

其他試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清(批號(hào)03/17、F7676，美國(guó)Gibco公司)；CCK8試劑盒(批號(hào)CK04，上海東仁科技公司)；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(批號(hào)40302ES20，南京凱基生物公司)；TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1 ELISA試劑盒(批號(hào)CSB-E04740h、CSB-E04638h、CSB-E04574h、CSB-E04753h，武漢華美生物公司)；RNAiso Plus、Prime ScriptTMRT Reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM(批號(hào)9109、RR037A、RR420A，Takara公司)；兔抗NF-κB p65抗體、兔抗GAPDH、小鼠抗兔二抗(批號(hào)8242、5174S、14708s，美國(guó)CST公司)；miR-181b mimics、miR-181b inhibitor(批號(hào)5632、5634，上海吉瑪制藥公司)。引物均由廣州天駿公司合成。

儀器：超凈臺(tái)(香港力康生物醫(yī)療集團(tuán))；細(xì)胞培養(yǎng)箱、MK3型酶標(biāo)定量測(cè)定儀、反轉(zhuǎn)錄儀及熒光定量PCR系統(tǒng)(美國(guó)Thermo公司)；Echo-Plus型全自動(dòng)生化儀(意大利愛康公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman Coulter公司)；TSl00-F型Eclipse Ti熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Image Station 2000MM多功能成像系統(tǒng)(美國(guó)Kodak公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞分組

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞隨機(jī)分為5組：對(duì)照組、模型組(100 μmol/L ox-LDL干預(yù)24 h)、LIG低濃度組、LIG中濃度組、LIG高濃度組。其中，LIG低、中、高濃度組細(xì)胞分別以10、20、40 μmol/L預(yù)先孵育2 h，再用100 μmol/L ox-LDL干預(yù)24 h。分別檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡情況。

1.3.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

將第3代對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期細(xì)胞按1 × 105/mL密度接種于96孔板上，每組6個(gè)孔，常規(guī)培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)基，分為空白組、陰性對(duì)照組、模型組、LIG低中高濃度組，其中LIG每組分別加入10、20、40 μmol/L LIG預(yù)先孵育2 h，每孔再加入5 g/L的CCK-8液10 μL，置于培養(yǎng)箱孵育1 ～ 2 h，然后于酶標(biāo)儀460 nm處檢測(cè)OD值。計(jì)算公式如下：存活率(%)=(As - Ab)/(Ac - Ab) × 100%，其中，As、Ab和Ac分別是實(shí)驗(yàn)組(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基和藥物)、空白組(不含細(xì)胞的培養(yǎng)基)和陰性對(duì)照組的吸光度(含有細(xì)胞的培養(yǎng)基)。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

細(xì)胞分組干預(yù)后離心收集，加入100 μL binding buffer混勻，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI染色液，輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)10 min，再加入400 μL binding buffer混勻，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)。

1.3.4 炎性細(xì)胞因子檢測(cè)

采用ELISA法，將細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞皿，細(xì)胞分組處理同前。培養(yǎng)終止后，吸出培養(yǎng)液，用PBS充分洗滌后將其轉(zhuǎn)移到離心管，用PBS稀釋到10 × 106/mL，-20℃過(guò)夜(兩輪反復(fù)凍融破壞細(xì)胞)，4℃、5 × 104r/min離心5 min，取上清液按說(shuō)明書進(jìn)行操作，分別計(jì)算細(xì)胞中TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1的濃度。

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

提取細(xì)胞總RNA，合成cDNA：總反應(yīng)體系20 μL，組成為14 μL模板RNA，2 μL enzyme mix，5 × RT緩沖液4 μL，42℃反應(yīng)60 min，95℃反應(yīng)5 min，將合成好的cDNA保存于-20℃。熒光定量PCR：總反應(yīng)體系20 μL由2 × PCR反應(yīng)混合物10 μL、cDNA 1 μL、目的基因引物0.5 μL、20 × SYBR 1 μL與H2O 7.5 μL組成。95℃反應(yīng)10 min，再轉(zhuǎn)向95℃ 10 s，60℃ 1 min共40個(gè)循環(huán)。目的基因與內(nèi)參GAPDH的引物序列見表1，相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct表示，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 目的基因與內(nèi)參的引物序列Table 1 Primer sequences for target genes and the internal control gene

1.3.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法進(jìn)行定量，按照每孔上樣50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，積層膠和分離膠濃度分別為5%和12%，采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)膜70 min，將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過(guò)夜(1∶2000)，二抗37℃孵育1 h(1∶5000)，ECL法顯色成像，圖像采用Image Tool 3.0分析光密度值(IOD)，實(shí)驗(yàn)設(shè)立GAPDH為內(nèi)參照，重復(fù)3次以上。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 藁本內(nèi)酯對(duì)HUVEC細(xì)胞增殖及凋亡的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL能顯著誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞損傷，抑制細(xì)胞存活率，促進(jìn)其凋亡。中、高濃度LIG預(yù)處理2 h能減輕HUVEC損傷，與模型組相比差異有顯著性(P< 0.01，表2)，說(shuō)明LIG具有減輕ox-LDL誘導(dǎo)的HUVEC細(xì)胞損傷作用。

2.2 藁本內(nèi)酯對(duì)HUVEC內(nèi)炎性細(xì)胞因子含量的影響

與對(duì)照組相比，ox-LDL能顯著增加細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1等促炎細(xì)胞因子及細(xì)胞黏附分子分泌，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞損傷。LIG各濃度組可明顯抑制這些細(xì)胞因子的分泌，與模型組相比差異有顯著性(P< 0.01，表3)，提示LIG可能主要通過(guò)抑制炎性因子分泌，減輕細(xì)胞炎癥反應(yīng)，從而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。LIG具有一定的抗炎作用，這也與文獻(xiàn)報(bào)道一致[7]。

2.3 藁本內(nèi)酯對(duì)HUVEC內(nèi)炎性因子及miR-181b mRNA水平的影響

為進(jìn)一步探討LIG對(duì)TNF-α、IL-6等炎性因子的表達(dá)調(diào)控，本研究檢測(cè)了這些細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄水平。中、高濃度LIG預(yù)處理組能顯著降低TNF-α、IL-6、ICAM-1及VCAM-1的轉(zhuǎn)錄水平，與模型組相比差異有顯著性(P< 0.01，表4)，說(shuō)明LIG能降低TNF-α、IL-6等炎性因子的轉(zhuǎn)錄水平，從而抑制HUVEC細(xì)胞分泌水平。同時(shí)，本研究還檢測(cè)了炎癥重要調(diào)節(jié)因子NF-κB的上游調(diào)控miRNA——miR-181b的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)LIG中、高濃度組可以明顯降低NF-κB的水平和增加miR-181b的水平，因此推測(cè)LIG可能會(huì)通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)起到抗炎作用。

表2 各組細(xì)胞存活率及凋亡率Table 2 Viability and apoptosis rate of HUVEC in each group

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與對(duì)照組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表3 各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子的含量Table 3 Levels of inflammatory cytokines in HUVEC of each group

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與對(duì)照組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表4 各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子及miR-181b mRNA相對(duì)表達(dá)量Table 4 mRNA levels of inflammatory cytokines and miR-181b in each group

注：與模型組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與對(duì)照組相比，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the model group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the control group,#P< 0.05,##P< 0.01.

表5 各組細(xì)胞內(nèi)炎性因子的濃度Table 5 Concentration of inflammatory cytokines in HUVEC of each group

注：與ox-LDL組相比，**P< 0.01。

Note. Compared with the ox-LDL group,**P< 0.01.

2.4 藁本內(nèi)酯對(duì)HUVEC內(nèi)NF-κB蛋白表達(dá)的調(diào)控

本研究采用Western blotting法檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)NF-κB的蛋白水平，結(jié)果顯示，ox-LDL能顯著增加NF-κB蛋白表達(dá)，而LIG則能明顯降低其表達(dá)，與模型組相比差異有顯著性(P< 0.01，圖2)。為進(jìn)一步探討LIG對(duì)HUVEC內(nèi)NF-κB調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究采用miR-181b mimics或miR-181b inhibitor分別激活或抑制細(xì)胞內(nèi)miR-181b表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-181b mimics可以明顯抑制炎癥因子TNF-α、IL-6及NF-κB水平，而miR-181b inhibitor結(jié)果剛好相反，并且miR-181b inhibitor削弱了LIG對(duì)HUVEC細(xì)胞炎癥因子的調(diào)控作用(P< 0.01，表5)，提示LIG很可能通過(guò)上調(diào)miR-181b表達(dá)，從而下調(diào)NF-κB表達(dá)，抑制細(xì)胞內(nèi)炎癥反應(yīng)。

注：C：對(duì)照組；M：模型組；LH：藁本內(nèi)酯高濃度組；LM：藁本內(nèi)酯中濃度組；LL：藁本內(nèi)酯低濃度組。圖2 各組細(xì)胞內(nèi)NF-κB的蛋白含量Note. C: Control group; M: Model group; LH: High concentration of ligustilide group; LM: Medium concentration of ligustilide group; LL: Low concentration of ligustilide group.Figure 2 NF-κB protein level in HUVEC of each group

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種主要累及大中彈力血管的慢性、進(jìn)行性、炎癥性疾病。炎性反應(yīng)存在于AS的各個(gè)階段，從血管內(nèi)膜的脂質(zhì)沉積、斑塊形成、進(jìn)展、再到破裂，血栓形成，核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)是調(diào)節(jié)炎癥最重要的轉(zhuǎn)錄因子。因此，抑制NF-κB信號(hào)可以延緩AS斑塊的進(jìn)展[8-9]。

ox-LDL既可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥及氧化損傷，導(dǎo)致其功能降低。同時(shí)，ox-LDL還可以促進(jìn)單核細(xì)胞分化成向巨噬細(xì)胞，并與巨噬細(xì)胞膜上的特異性受體Lox-1結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，越來(lái)越多的ox-LDL不斷被轉(zhuǎn)運(yùn)至巨噬細(xì)胞內(nèi)后即形成泡沫細(xì)胞，大量泡沫細(xì)胞堆積到血管內(nèi)壁即形成AS鏡下可見的最早病變——脂紋[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中，ox-LDL可促進(jìn)HUVEC細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6、ICAM-1和VCAM-1增多，抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。說(shuō)明ox-LDL可明顯誘導(dǎo)HUVEC出現(xiàn)炎癥樣損傷。

冠心病病人血清中TNF-α及IL-6的水平顯著高于正常人群，而在AS小鼠的血清中二者水平也明顯高于對(duì)照組小鼠，可以作為AS小鼠炎癥的血清標(biāo)記物。血中TNF-α及IL-6濃度增高一方面可進(jìn)一步增強(qiáng)血管及斑塊局部的炎癥反應(yīng)，另一方面可不斷刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致其生理功能受損，血管壁最內(nèi)層的保護(hù)屏障被破壞，從而使得大量炎性細(xì)胞遷移、沉積于此。ICAM-1與VCAM-1可介導(dǎo)循環(huán)系統(tǒng)中白細(xì)胞特別是單核細(xì)胞與活化血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附并遷移聚集于內(nèi)膜下，過(guò)度攝取脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，大量的泡沫細(xì)胞堆積逐漸形成粥樣斑塊[12-13]。

越來(lái)越多的研究表明，很多清熱解毒及活血化瘀類中藥都具有抗AS的功效，比如三七、丹參、黃連、虎杖、當(dāng)歸等[14-16]。藁本內(nèi)酯即是從中藥當(dāng)歸、川芎中提取分離出的活性成分，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明其具有抗AS損傷作用，然而其機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，藁本內(nèi)酯具有保護(hù)HUVEC的藥理作用。10、20、40 μmol/L LIG預(yù)處理細(xì)胞2 h，可顯著減輕ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥損傷。LIG不僅能促進(jìn)HUVEC增殖，抑制其凋亡，還能降低細(xì)胞內(nèi)TNF-α、IL-6、ICAM-1與VCAM-1等細(xì)胞因子的分泌，有效抑制ox-LDL誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)。為探討LIG抗炎的具體機(jī)制，本研究檢測(cè)了HUVEC細(xì)胞內(nèi)NF-κB及其上游miR-181b的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ox-LDL能顯著上調(diào)炎癥調(diào)控關(guān)鍵環(huán)節(jié)NF-κB mRNA和蛋白的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)miR-181b的mRNA水平。miR-181b被證實(shí)是NF-κB上游的重要調(diào)控基因，在多種細(xì)胞或組織中均能調(diào)節(jié)NF-κB的表達(dá)。為驗(yàn)證LIG是否通過(guò)miR-181b調(diào)節(jié)NF-κB表達(dá)，從而降低HUVEC細(xì)胞炎癥反應(yīng)，本研究分別采用miR-181b mimics或miR-181b inhibitor上調(diào)或下調(diào)miR-181b水平，再觀察細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)炎性因子的分泌情況。數(shù)據(jù)顯示，miR-181b mimics能顯著減輕細(xì)胞損傷，降低炎性因子TNF-α、IL-6、NF-κB水平；miR-181b inhibitor則剛好相反。LIG和miR-181b inhibitor共同處理細(xì)胞后，削弱了LIG的細(xì)胞保護(hù)作用，同時(shí)增加了TNF-α、IL-6與NF-κB的濃度，說(shuō)明LIG很可能通過(guò)上調(diào)miR-181b水平從而降低ox-LDL誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞炎癥水平，NF-κB是這一過(guò)程的重要中間環(huán)節(jié)。

由于時(shí)間和經(jīng)費(fèi)限制，此次本研究未能在動(dòng)物水平驗(yàn)證LIG抗AS的藥理作用是否與調(diào)控miR-181b/NF-κB途徑有關(guān)，這也將是本課題組后期工作的重要內(nèi)容。