王澤群 綜述 魏素菊 審校

(河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，石家莊 050011)

近年來(lái)，腫瘤的免疫治療成為繼分子靶向治療之后的新熱點(diǎn)。以B7/CD28家族成員如PD-1和PD-L1為靶點(diǎn)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的新的免疫療法，最近已經(jīng)被用于人肺癌的治療并獲益。HHLA2是一種新發(fā)現(xiàn)的B7家族成員，與T細(xì)胞的抑制性功能有關(guān)。在大多數(shù)正常組織中未檢測(cè)到HHLA2蛋白表達(dá)，而在人類(lèi)一些惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)。HHLA2可能在腫瘤微環(huán)境中是一種新的免疫抑制機(jī)制，同樣也是腫瘤免疫治療的新靶點(diǎn)。HHLA2目前的研究還相對(duì)較少，本文就HHLA2的分子結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式、相關(guān)受體、功能作用及其與相關(guān)腫瘤的關(guān)系等作一綜述，旨在為相關(guān)腫瘤的治療進(jìn)展提供新的參考。

1 HHLA2的生物學(xué)結(jié)構(gòu)及演變

HHLA2是人類(lèi)內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒-H長(zhǎng)末端重復(fù)序列結(jié)合體2(HERV-H LTR-associating)的簡(jiǎn)稱(chēng)[1]。人類(lèi)的HHLA2基因位于3號(hào)染色體q13.13區(qū)域，與B7-1和B7-2基因相鄰(q13.3-q21)。研究人員按順序排列了開(kāi)放閱讀框架發(fā)現(xiàn)HHLA2的導(dǎo)出蛋白序列含有414個(gè)氨基酸比大多數(shù)B7成員要長(zhǎng)，但是比人B7-H3要短。普遍認(rèn)為HHLA2蛋白具有一個(gè)氨基酸末端信號(hào)肽，外功能區(qū)由串聯(lián)的IgV-IgC-IgV的結(jié)構(gòu)域、六N-連接糖基化的潛力點(diǎn)、一個(gè)跨膜區(qū)和49-aa胞質(zhì)尾構(gòu)成。HHLA2是一種擁有三個(gè)胞外Ig區(qū)域(IgV-IgC-IgV)的Ⅰ型跨膜分子，而B(niǎo)7家族的其他成員只有兩個(gè)Ig區(qū)域(IgV-IgC)。為了驗(yàn)證這一結(jié)論，研究人員在小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(3T3)細(xì)胞系中研究了HHLA2蛋白定位表達(dá)HHLA-YFP融合蛋白，并不表達(dá)內(nèi)源性HHLA。共聚焦顯微鏡分析表明，HHLA2蛋白主要存在于3T3細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中。相反，人CTLA-4-YFP融合蛋白主要定位在3T3細(xì)胞內(nèi)[2]。

在之前的研究中，研究人員應(yīng)用進(jìn)化分析將B7家族分為三組[3]。隨著HHLA2加入B7這個(gè)大家族，研究人員應(yīng)用PAUP 4.0b10[4]來(lái)評(píng)估人類(lèi)B7蛋白質(zhì)之間的關(guān)系。如圖1所示[2]，系統(tǒng)地比較將B7家族分為三組：第1組包括B7-1、B7-2和B7h，第2組包括PD-L1和PD-L2，第3組包括B7x、HHLA2和B7-H3[3]。對(duì)第1組來(lái)說(shuō)，CD28和CTLA4是這三個(gè)B7分子的受體，ICOS是B7h的受體而PD-L1結(jié)合B7-1。第2組，PD-1為PD-L1和PD-L2的受體。對(duì)第3組來(lái)說(shuō)，TMIGD2作為HHLA2的受體之一[1,5]，其他受體尚未確定。系統(tǒng)進(jìn)化的比較表明第3組的受體與第1、2組的受體并不是真正的同系物?；谛蛄蟹治霰砻鳎毡檎J(rèn)為HHLA2同源基因似乎在現(xiàn)有廣泛的物種中存在，包括魚(yú)類(lèi)、青蛙、裸鼴鼠、大熊貓和猴子等靈長(zhǎng)類(lèi)物種。然而，相比其他B7 家庭成員，HHLA2在實(shí)驗(yàn)室小鼠和小鼠菌株中并不表達(dá)，使其成為第一個(gè)在人類(lèi)中表達(dá)而在小鼠中不表達(dá)的B7家族成員[2]。

2 HHLA2的表達(dá)模式

目前HHLA2的表達(dá)在蛋白質(zhì)水平是完全未知的[2]。為了檢測(cè)蛋白質(zhì)的表達(dá)，由于小鼠不表達(dá)HHLA2基因，研究人員生成了來(lái)自小鼠的一個(gè)單克隆抗體小組來(lái)對(duì)抗HHLA2。單克隆抗體的特異性是應(yīng)用ELISA和流式細(xì)胞儀證實(shí)單克隆抗體是與HHLA2反應(yīng)而不是其他B7家族成員。使用抗HHLA2單克隆抗體566.1，應(yīng)用流式細(xì)胞儀在抗原提呈細(xì)胞上檢測(cè)到HHLA2的表達(dá)。在人外周血單核細(xì)胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中的CD14陽(yáng)性的單核細(xì)胞顯著表達(dá)了HHLA2，這種表達(dá)被LPS和IFN-γ的刺激進(jìn)一步調(diào)節(jié)。靜息CD19陽(yáng)性B細(xì)胞不表達(dá)HHLA2，但是可被LPS和IFN-γ誘導(dǎo)表達(dá)。盡管在LPS和IFN-γ刺激后，HHLA2在樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞中仍不表達(dá)。未來(lái)還需要進(jìn)一步研究證實(shí)是否存在其他刺激可以誘導(dǎo)HHLA2在樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞中表達(dá)[2]。HHLA2在正常組織中的表達(dá)是有限的。研究表明大多數(shù)正常組織在蛋白質(zhì)水平上并不表達(dá)內(nèi)源性HHLA2，然而在胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞、腸道、腎臟、膽囊和乳腺上皮細(xì)胞中可表達(dá)HHLA2[6]。

3 TMIGD2，HHLA2的受體之一

HHLA2受體可以在包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞中被找到。目前研究人員已經(jīng)確定了HHLA2的受體之一，TMIGD2，也稱(chēng)為CD28H。TMIGD2可以在上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞起源的細(xì)胞中被檢測(cè)到，而且當(dāng)在內(nèi)皮細(xì)胞系過(guò)表達(dá)時(shí)可以增加體外血管生成[7,8]。另外，TMIGD2作為一個(gè)興奮性受體表達(dá)于幼稚T細(xì)胞表面。向CD28家族其他成員一樣，TMIGD2是存在一個(gè)胞外IgV結(jié)構(gòu)域、一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)胞質(zhì)尾的Ig總科成員之一。細(xì)胞外區(qū)域有兩個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)，胞質(zhì)尾包含可被磷酸化的酪氨酸殘基和與多重SH3信號(hào)分子相關(guān)的脯氨酸結(jié)構(gòu)域[8]。和HHLA2一樣，TMIGD2不存在于小鼠中而存在于人和靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中[7]。通過(guò)序列分析，研究人員分析，TMIGD2、IGPR-1和CD28H是同一種分子，IGPR-1最初被認(rèn)定為一個(gè)參與血管生成的黏附分子，而CD28H是最近報(bào)道的高通量跨膜蛋白的受體[6]。

4 HHLA2的功能及作用

4.1HHLA2抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的CD4和CD8 T細(xì)胞的增殖 研究數(shù)據(jù)顯示，在抗原提呈細(xì)胞(APCs)中可檢測(cè)到HHLA2蛋白，而且在T細(xì)胞上有HHLA2受體表達(dá)。研究人員應(yīng)用改進(jìn)的系統(tǒng)檢測(cè)HHLA2是否能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能[3]。在這個(gè)系統(tǒng)中，提純的T細(xì)胞被盤(pán)狀包裹的CD3的單克隆抗體激活，這種T細(xì)胞的激活在3～5 d內(nèi)可被檢測(cè)到。研究人員首先進(jìn)行了抗CD3劑量滴定，發(fā)現(xiàn)從不同的正常獻(xiàn)血者來(lái)源的T細(xì)胞，需要不同濃度的抗CD3以達(dá)到中等水平的增殖。因此，每個(gè)捐獻(xiàn)者的T細(xì)胞試驗(yàn)應(yīng)用不同的適宜濃度的抗CD3[2]。研究人員應(yīng)用噻唑藍(lán)試驗(yàn)，在固定化HHLA2-Ig、對(duì)照Ig或B7x-Ig存在的情況下量化抗CD3引起的T細(xì)胞的激活。HHLA2-Ig顯著降低抗CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞的活化。作為對(duì)照，在同一系統(tǒng)中B7x-Ig同樣抑制T細(xì)胞激活，符合之前的報(bào)道[3]。由于CD4和CD8 T細(xì)胞組成性地表達(dá)HHLA2受體，研究人員下一步檢測(cè)HHLA2是否可以抑制CD4和CD8 T細(xì)胞。從PBMCs中提純的T細(xì)胞被琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluorecein succinimidyl amino ester,CFSE)標(biāo)記，并在固定化HHLA2-Ig、對(duì)照Ig或B7x-Ig存在的情況下應(yīng)用抗CD3刺激5 d。這些細(xì)胞應(yīng)用抗CD4和抗CD8進(jìn)行流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。HHLA2介導(dǎo)的抑制作用，是由控制CD4和CD8 T細(xì)胞的數(shù)量和測(cè)量CFSE的熒光強(qiáng)度決定的。不出所料，當(dāng)應(yīng)用抗CD3和對(duì)照Ig培養(yǎng)時(shí)，CD4和CD8 T細(xì)胞都大量增殖，有超過(guò)55%的CD4和超過(guò)69%的CD8 T細(xì)胞分裂。然而，當(dāng)應(yīng)用抗CD3和HHLA2-Ig培養(yǎng)T細(xì)胞時(shí)，CD4和CD8 T細(xì)胞增殖顯著減少，有不超過(guò)38%的CD4和不超過(guò)52%的CD8 T細(xì)胞分裂。類(lèi)似的，B7x-Ig也抑制CD4和CD8 T細(xì)胞增殖，只有不到44%的CD4 T細(xì)胞和不到57%的CD8 T細(xì)胞分裂。因此，這些分析的結(jié)果證明，HHLA2抑制T細(xì)胞受體介導(dǎo)的人CD4和CD8 T細(xì)胞增殖，抑制程度與B7x類(lèi)似[2]。

4.2HHLA2抑制T細(xì)胞分泌細(xì)胞因子 研究人員把從PBMCs中提純的T細(xì)胞在固定化HHLA2-Ig或?qū)φ誌g存在的情況下應(yīng)用抗CD3刺激3 d[2]。結(jié)果顯示，從檢測(cè)的13個(gè)T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子中，發(fā)現(xiàn)有7個(gè)T細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞因子的分泌顯著降低：IFN-γ(降低21%)、TNF-α(降低30%)、IL-5(降低39%)、IL-10(降低56%)IL-13(降低39%)、IL-17A(降低36%)、IL-22(降低35%)。HHLA2減少了IL-2和IL-9的分泌，但是差異并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[2]。此外，HHLA2并不影響細(xì)胞因子IL-1β、IL-4、IL-6或IL-12p70的分泌。這些研究結(jié)果顯示，HHLA2可以抑制T細(xì)胞產(chǎn)生某些細(xì)胞因子。

5 HHLA2與相關(guān)腫瘤

研究證實(shí)，HHLA2在大多數(shù)惡性腫瘤組織中高度表達(dá)，包括乳腺癌、肺癌、甲狀腺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、食管癌。這表明HHLA2表達(dá)可能是腫瘤進(jìn)展的關(guān)鍵步驟，而且HHLA2可以通過(guò)對(duì)宿主抗腫瘤免疫的抑制賦予腫瘤生存優(yōu)勢(shì)[6]。HHLA2表達(dá)上調(diào)至少有兩個(gè)機(jī)制：①炎癥刺激。單核巨噬細(xì)胞可以使HHLA2表達(dá)增加，并在LPS和IFN-γ的刺激下，HHLA2可被誘導(dǎo)表達(dá)于B細(xì)胞。②人類(lèi)基因組的基因拷貝數(shù)增加?；蚩截悢?shù)分析顯示，絕大多數(shù)的HHLA2基因拷貝數(shù)在基底型乳腺癌中是增加的(>95%),這表明基因拷貝數(shù)的增加是癌癥中HHLA2表達(dá)上調(diào)的機(jī)制之一。HHLA2的表達(dá)與兩個(gè)預(yù)后因素有關(guān)：腫瘤晚期和淋巴結(jié)陽(yáng)性，但與腫瘤的大小無(wú)關(guān)[6]。

5.1HHLA2與非小細(xì)胞肺癌 HHLA2在正常肺組織中并不表達(dá)，但在不同亞型的肺癌中廣泛表達(dá)。研究已經(jīng)證實(shí)，在66%的肺癌中存在HHLA2表達(dá)[9]。

HHLA2與肺腺癌中表皮生長(zhǎng)因子受體(Epidermal growth factor receptor,EGFR)突變狀態(tài)有關(guān)。EGFR和KRAS基因突變是非小細(xì)胞肺癌中最常見(jiàn)的致癌基因改變。存在這些突變的肺癌患者有不同的發(fā)病機(jī)制、臨床特點(diǎn)及病程[10]。在不同的突變類(lèi)型中研究人員分析了HHLA2表達(dá)。在發(fā)現(xiàn)隊(duì)列中，HHLA2染色陽(yáng)性被發(fā)現(xiàn)在EGFR突變中占75.6%(31/41)，KRAS突變的62.9%，在野生型(EGFR和KRAS野生型)患者中占52.7%。在他們中，在EGFR突變的肺癌患者中的HHLA的表達(dá)顯著高于野生型的患者(P=0.015)。類(lèi)似的，在驗(yàn)證隊(duì)列中，與野生型相比，EGFR突變的腫瘤HHLA2的表達(dá)明顯增高(89% vs 69%，P=0.01)[9]。

HHLA2與肺腺癌中TILs高含量有關(guān)。腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)與HHLA2表達(dá)之間的關(guān)系正在研究中。腫瘤浸潤(rùn)性淋巴細(xì)胞已經(jīng)被證明可以預(yù)示一些腫瘤的預(yù)后，但肺癌組織中TILs的預(yù)測(cè)價(jià)值仍存在爭(zhēng)議。在一些研究中，高密度的TIL已經(jīng)被證實(shí)在早期肺癌中無(wú)病生存率和無(wú)復(fù)發(fā)生存率較低[11]，但在另一些研究中沒(méi)有相關(guān)記錄[12]。在另一方面，在肺腺癌中，在適應(yīng)突變狀態(tài)以后，高TILs浸潤(rùn)和HHLA2表達(dá)之間有顯著的關(guān)聯(lián)。這表明，可能有不同的因素參與TIL募集，而在肺腺癌中HHLA2表達(dá)可能至少是參與TIL浸潤(rùn)的一部分。HHLA2結(jié)合多種免疫細(xì)胞的受體，包括T細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，從而抑制人體CD4和CD8 T細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]。

5.2HHLA2與乳腺癌 HHLA2在乳腺癌的蛋白質(zhì)水平過(guò)表達(dá)，但是腫瘤細(xì)胞表達(dá)上調(diào)的機(jī)制尚不清楚[1]。三陰乳腺癌與雌激素受體陽(yáng)性和HER2陽(yáng)性乳腺癌相比是更具侵襲性乳腺癌亞型。在一項(xiàng)回顧性研究中，收集了50例局部或局部進(jìn)展的乳腺癌患者，并收集他們的臨床特點(diǎn)[1]。所有這些患者以手術(shù)作為主要治療，后續(xù)行術(shù)后輔助化療或放療或術(shù)后放化療。存在HHLA2高表達(dá)的三陰乳腺癌患者與淋巴結(jié)陽(yáng)性和診斷時(shí)已晚期有關(guān)，表明與HHLA2低表達(dá)的三陰乳腺癌相比，HHLA2高表達(dá)的三陰乳腺癌更具有侵襲性。通過(guò)CbioPortal評(píng)估HHLA2基因變異，研究人員發(fā)現(xiàn)在基底型中有32%的HHLA2基因變異，而且在基底型乳腺癌中HHLA2基因拷貝數(shù)絕大多數(shù)是增加的(>95%)[1]。這表明在人類(lèi)腫瘤中HHLA2蛋白上調(diào)的機(jī)制之一可能是基因拷貝數(shù)的增加[6]。

5.3HHLA2與骨肉瘤 研究人員發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)骨肉瘤中都有HHLA2的表達(dá)。HHLA2在骨肉瘤中的預(yù)后作用最近被提出[13]。同時(shí)這項(xiàng)研究表明在骨肉瘤中，HHLA2與PD-L1是共表達(dá)的。在已經(jīng)評(píng)估過(guò)PD-L1表達(dá)的一群病例樣本中，可以檢測(cè)到HHLA2的表達(dá)[14]。另外，在骨肉瘤中，HHLA2的表達(dá)與特異性免疫細(xì)胞亞型的腫瘤浸潤(rùn)有關(guān)。然而HHLA2的表達(dá)與高齡(50% vs 63%,P=0.66)、更糟的解剖部位(58% vs 67%,P=0.18)、在診斷中是否存在轉(zhuǎn)移(67% vs 39%,P=0.18)、新輔助化療的組織學(xué)應(yīng)答(67% vs 36%,P=0.54)均沒(méi)有關(guān)系，但是在這項(xiàng)研究中，HHLA2在轉(zhuǎn)移性骨肉瘤中比在原發(fā)性骨肉瘤中的表達(dá)更多，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(93% vs 53%，P=0.02)[13]。在腫瘤中HHLA2的高水平表達(dá)(25% vs 50%)預(yù)示著總生存率的下降。HHLA2在腫瘤微環(huán)境中作為T(mén)細(xì)胞的共抑制分子的功能可以為腫瘤生存提供有利條件，因此HHLA2的表達(dá)與較差的預(yù)后有關(guān)[1]。還需要進(jìn)一步的分析來(lái)評(píng)估HHLA2表達(dá)與骨肉瘤中預(yù)后不良的高危因素之間的關(guān)系[13]。

6 小結(jié)與展望

B7/CD28家族的配體和受體在正常狀態(tài)或在感染、自身免疫和癌癥等病理狀態(tài)下的免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)中扮演重要的角色[1]。HHLA2作為新發(fā)現(xiàn)的B7家族的一員，具有抑制T細(xì)胞的功能，TMIGD2作為HHLA2的受體之一在最近的報(bào)道中被提出。HHLA2與B7x、B7-H3同屬于B7家族的第三組成員，但目前這些免疫檢查點(diǎn)是如何協(xié)同起作用的還需要進(jìn)一步的研究。但目前，受體的識(shí)別、缺乏可靠的有價(jià)值的抗體、HHLA2和TMIGD2在小鼠中表達(dá)的缺乏等問(wèn)題仍然存在。盡管如此，體內(nèi)和體外的研究都強(qiáng)調(diào)了這些新的受體和配體的重要性。HHLA2有可能成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)，如何抑制HHLA2通路，從而為腫瘤、感染及自身免疫疾病提供新的治療策略，還需要進(jìn)一步的研究。

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