姜智星 楊 森 陳 琛 梁敏銳 鄒和建

(復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院風(fēng)濕科,上海 200000)

系統(tǒng)性硬化癥(Systemic sclerosis，SSc)是一種以皮膚、肺等多器官發(fā)生炎癥、血管病變、纖維化為特征的慢性自身免疫性疾病。內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)與SSc早期血管病變有關(guān)，在血管重塑中起到重要作用[1]。其中，自身免疫誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子及黏附因子最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及凋亡[2]。血管病變主要包括肺動(dòng)脈高壓、雷諾現(xiàn)象、指端潰瘍，嚴(yán)重影響患者預(yù)后及生活治療，目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮素-1、Fli-1(Friend leukemia virus integration 1,Fli-1)、血管緊張素Ⅱ1型受體(Angiotensin Ⅱ type 1 receptor，AT1R)、內(nèi)皮素受體A(Endothelin-1 type A receptor，ETAR)等血管舒縮因子可通過(guò)作用于SSc患者血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮其生物學(xué)功能，參與SSc血管病變進(jìn)程[3-5]。

CXCL4[Chemokine(C-X-C motif)ligand 4，CXCL4]是由70個(gè)氨基酸組成的，分子量為7.8 kD的趨化因子。其特異性受體為CXCR3，可通過(guò)干擾血管生成因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)和成纖維生成因子(Fibroblast growth factors,FGF)的生成發(fā)揮抗血管生成等作用。CXCL4可以與這些促血管生成因子結(jié)合，從而阻斷其特異性受體6,7，或通過(guò)與FGF或VEGF競(jìng)爭(zhēng)細(xì)胞表面硫酸乙酰肝素蛋白多糖[7,8]，拮抗血管生成。既往研究發(fā)現(xiàn)，CXCL4在SSc患者體內(nèi)血清學(xué)水平較健康人群明顯升高，且在SSc伴肺動(dòng)脈高壓患者中CXCL4升高尤為明顯[9]。然而具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。

因HDMEC廣泛用于研究SSc血管病變機(jī)制研究中，故本研究旨在探討CXCL4對(duì)HDMEC的增殖和血管形成功能，及其分泌內(nèi)皮素-1、Fli-1、AT1R、ETAR的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料、試劑 原代HDMEC購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；內(nèi)皮細(xì)胞完全生長(zhǎng)培養(yǎng)液購(gòu)自Promocell公司；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；CXCL4購(gòu)自PeproTech 公司，anti-CXCL4 antibody購(gòu)自R&D公司；CCK-8細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒購(gòu)自日本同仁化學(xué)所；基質(zhì)膠購(gòu)自BD公司；TRIZOL購(gòu)自Invitrogen公司；PrimeScript RT reagent kit及SYBR Green PCR Master mix 購(gòu)自TaKaRa公司；引物由上海生物工程有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 原代HDMEC細(xì)胞采用內(nèi)皮細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO2環(huán)境下，待細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)傳代，實(shí)驗(yàn)所用為第3～7代細(xì)胞。

1.2.2CXCL4對(duì)HDMEC增殖的影響 將HDMEC分5組接種于96孔板，依次為對(duì)照組，CXCL4組(終濃度為5、10、20 ng/ml)及CXCL4+CXCL4拮抗劑組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞密度為104個(gè)/孔。24 h 后應(yīng)用無(wú)血清內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h，后換為含10%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，并加入CXCL4。分別干預(yù)24、48 h后將培養(yǎng)基更換為無(wú)血清內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液(100 μl/孔)，并加入CCK-8試劑10 μl處理2 h。最后在酶標(biāo)儀上檢測(cè)每組在450 nm的吸光度(A)值。參照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)計(jì)算細(xì)胞活力。

1.2.3實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time PCR) 將HDMEC接種于24孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，細(xì)胞密度為105個(gè)/孔，按上述分組干預(yù)細(xì)胞。24 h后用TRIZOL法提取RNA，根據(jù)PrimeScript RT reagent kit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，按照SYBR Green PCR Master mix試劑盒說(shuō)明書(shū)在ABI 7500 Fast Real-Time PCR System上進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)。反應(yīng)條件為：95℃變性5 min;95℃15 s，60℃34 s,循環(huán)40次；60℃延伸30 s，結(jié)果以Ct值表示，通過(guò)ΔΔCt法進(jìn)行分析。并運(yùn)用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)CXCR3、內(nèi)皮素-1、Fli-1、AT1R、ETAR的mRNA引物，以GAPDH為內(nèi)參。CXCR3及GAPDH的PCR產(chǎn)物行10 g/L瓊脂糖凝膠電泳。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.4體外血管形成實(shí)驗(yàn) 將HDMEC接種于6孔板，分CXCL4實(shí)驗(yàn)組(終濃度為20 ng/ml)及對(duì)照組。干預(yù)24 h后收集各組細(xì)胞，制成2×105ml單細(xì)胞懸液備用。將凍存的基質(zhì)膠放入4℃冰箱溶解過(guò)夜，鋪于96孔板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每孔鋪膠50 μl。放置于37℃孵箱30 min后每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，培養(yǎng)4 h后在相差顯微鏡下觀察每孔管腔形成并拍照計(jì)數(shù)。

2 結(jié)果

2.1CXCR3在HDMEC中表達(dá) RT-PCR結(jié)果顯示HDMEC有CXCL4特異性受體CXCR3的mRNA表達(dá)。見(jiàn)圖1。

2.2CXCL4對(duì)HDMEC增殖的影響 分別檢測(cè)5組(對(duì)照組，CXCL4濃度5、10、20 ng/ml組及CXCL4+拮抗劑組)在450 nm的A值，計(jì)算細(xì)胞增殖活力，結(jié)果顯示：各組在時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)的細(xì)胞增殖活性分別為100.00%±3.16%,92.14%±0.62%,85.14%±0.35%,74.99%±1.77%,99.11%±0.62%；對(duì)照組與CXCL4組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)；提示HDMEC細(xì)胞增殖能力隨著CXCL4濃度不斷升高而呈劑量依賴性下降。CXCL4+拮抗劑組與20 ng/ml的CXCL4組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明CXCL4拮抗劑能顯著減少CXCL4抑制HDMEC細(xì)胞增殖的能力。在時(shí)間點(diǎn)48 h時(shí)，5個(gè)組(對(duì)照組，CXCL4濃度5、10、20 ng/ml組及CXC4+拮抗劑組)的細(xì)胞增殖活性分別為100%±0.64%,95.45%±1.08%,94.63%±0.65%,93.56%±0.22%,98.42%±1.48%；對(duì)照組與CXCL4組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，CXCL4+拮抗劑組與20 ng/ml的CXCL4組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖2。

表1引物序列

Tab.1Primersequence

GenenamePrimersequence(5′→3′)CXCR3Forward：CCAACCACAAGTGCCAAAGGReverse：CCATAATCGTAGGGAGATGTGET?1Forward：GCTCGTCCCTGATGGATAAAReverse：CCATAACGGAACAACGTGCTFli?1Forward：GGATGGCAAGGAACTGTGTAAReverse：GGTTGTATAGGCCAGCAGAT1RForward：ATTTAGCACTGGCTGACTTATGCReverse：CAGCGGTATTCCATAGCTGTGETARForward：TCGGGTTCTATTTCTGTATGCCCReverse：TGTTTTTGCCACTTCTCGACGGAPDHForward：TGTGGGCATCAATGGATTTGGReverse：ACACCATGTATTCCGGGTCAAT

2.3CXCL4對(duì)HDMEC血管形成功能的影響 結(jié)果顯示，5個(gè)組(對(duì)照組，CXCL4濃度5、10、20 ng/ml組及CXC4+拮抗劑組)管腔形成數(shù)量分別為(51.70±8.74)個(gè)、(31.33±4.16)個(gè)、(24.33±2.08)個(gè)、(20.01±12.12)個(gè)、(49.02±3.00)個(gè)；對(duì)照組CXCL4組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.022，P<0.01，P=0.021)。CXCL4+拮抗劑組與20 ng/ml的CXCL4組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)圖3。

2.4CXCL4對(duì)HDMEC分泌內(nèi)皮素-1、Fli-1、AT1R、ETAR的mRNA表達(dá)水平的影響 Real-time PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，5個(gè)組(對(duì)照組，CXCL4終濃度5、10、20 ng/ml 組及CXC4+拮抗劑組)內(nèi)皮素-1基因的mRNA擴(kuò)增倍數(shù)分別為1.00±0.48，1.73±0.72,3.24±0.36，5.64±0.73，1.38±0.51；對(duì)照組與CXCL4組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.023，P<0.01，P<0.01)。CXCL4終濃度20 ng/ml組與CXCL4+拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Fli-1基因分別為1.00±0.35，0.73±0.54,0.11±0.23，0.03±0.06， 0.84±0.41； 對(duì)照組與CXCL4終濃度10、20 ng/ml組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。CXCL4終濃度20 ng/ml組與CXCL4+拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。AT1R基因分別為1.00±0.55，1.43±0.38,3.26±0.55，5.92±0.54，1.17±0.27；對(duì)照組與CXCL4終濃度10、20 ng/ml組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)。CXCL4終濃度20 ng/ml組與CXCL4+拮抗劑組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。ETAR基因分別為1.00±0.45，1.07±0.38,1.20±0.93，1.23±0.89，0.58±0.45；對(duì)照組與CXCL4組兩兩比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.70，P=0.57，P=0.49)，CXCL4終濃度20 ng/ml組與CXCL4+拮抗劑組比較差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)。見(jiàn)圖4。

圖1 CXCR3在HDMEC上表達(dá)Fig.1 CXCR3 expressed on HDMECs

圖2 CXCL4抑制HDMEC增殖Fig.2 CXCL4 inhibit proliferation of HDMECsNote:Compared with control group,**.P<0.01.

圖3 CXCL4抑制HDMEC血管形成數(shù)目Fig.3 CXCL4 inhibit number of tube formation on HDMECsNote:Compared with control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

圖4 CXCL4對(duì)內(nèi)皮素-1、Fli-1、AT1R、ETAR基因mRNA水平影響Fig.4 Effect of CXCL4 on mRNA expression of vasomo-tion factors in HDMECsNote:Compared with control group,*.P<0.05，**.P<0.01.

3 討論

血管損傷是SSc起病最早也是最主要的病變，其中微血管損傷和內(nèi)皮細(xì)胞活化是中心環(huán)節(jié)，可引起毛細(xì)血管減少，血管平滑肌增殖，血管壁增厚，管腔狹窄，組織缺氧以及氧化應(yīng)激等一系列病理生理改變[10]。近年來(lái)，CXCL4被證實(shí)在SSc病程中起到重要作用。由漿細(xì)胞/樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的CXCL4通過(guò)下調(diào)Fli-1基因表達(dá)使SSc患者血管系統(tǒng)中內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記降低，參與SSc血管病變[9]。此外，CXCL4可誘導(dǎo)促纖維化因子白介素-4(Interleukin-4,IL-4)和IL-13表達(dá)上調(diào)，抑制抗纖維化細(xì)胞因子干擾素-γ(Interferon-γ，IFN-γ)的表達(dá)[11]，還可通過(guò)干擾調(diào)節(jié)性T細(xì)胞參與免疫反應(yīng)[12]。然而關(guān)于CXCL4能否直接作用于內(nèi)皮細(xì)胞，影響血管生成因子表達(dá)尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL4能顯著抑制HDMEC增殖，抑制HDMEC血管形成功能，通過(guò)促進(jìn)內(nèi)皮素-1、AT1R基因的mRNA水平表達(dá)，抑制Fli-1基因mRNA水平表達(dá)，多種途徑發(fā)揮抗血管生成的作用。內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞活化，凋亡，分泌細(xì)胞因子異常，可導(dǎo)致血管重構(gòu)，動(dòng)脈粥樣硬化增多，毛細(xì)血管缺如，最終導(dǎo)致血管阻塞。而內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡被視為內(nèi)皮細(xì)胞損傷最直接的病理生理改變[13]。本研究中，應(yīng)用CCK-8的方法證實(shí)，在體外，CXCL4能抑制HDMEC增殖，并呈劑量依賴性。當(dāng)CXCL4的終濃度分別為5、10、20 ng/ml時(shí)，CXCL4表現(xiàn)出明顯的抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖作用，且進(jìn)一步利用針對(duì)CXCL4的拮抗劑與CXCL4同時(shí)干預(yù)細(xì)胞，結(jié)果顯示內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力較CXCL4干預(yù)組明顯增高，提示CXCL4可能通過(guò)抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖直接參與SSc血管病變。

內(nèi)皮細(xì)胞分泌細(xì)胞因子異常亦可導(dǎo)致血管損傷。內(nèi)皮素-1是一種由內(nèi)皮細(xì)胞分泌的強(qiáng)效收縮血管及促纖維化因子，在SSc患者及SSc伴指端潰瘍患者體內(nèi)血清學(xué)水平明顯升高[3]。波生坦作為內(nèi)皮素受體拮抗劑，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于臨床上治療SSc及預(yù)防SSc指端潰瘍的發(fā)生[14]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮素-1基因的mRNA水平可隨CXCL4終濃度升高而呈劑量依賴性升高，而CXCL4拮抗劑可顯著抑制這種升高趨勢(shì)。

近年來(lái)，有關(guān)Fli-1基因研究頗多。選擇性敲除內(nèi)皮細(xì)胞Fli-1基因的小鼠可下調(diào)經(jīng)典內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)，這些小鼠可表現(xiàn)為血管凋亡、缺如，血管重塑等類似SSc血管病變表現(xiàn)[4]。van Bon等研究發(fā)現(xiàn)CXCL4能通過(guò)下調(diào)Fli-1基因的mRNA和蛋白的表達(dá)引起血管損傷[9]。本研究亦提示，CXCL4能顯著下調(diào)Fli-1基因的mRNA水平。

目前認(rèn)為，AT1R和ETAR也參與了SSc疾病相關(guān)進(jìn)程[5]。在大多數(shù)SSc患者體內(nèi)可檢測(cè)出Anti-AT1R 和 anti-ETAR 抗體，這些自身抗體表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞上，與疾病活動(dòng)度和致死率呈正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)CXCL4可顯著升高AT1R基因的mRNA水平，但對(duì)ETAR基因表達(dá)無(wú)明顯改變。

既往研究中，CXCL4對(duì)血管損傷的作用機(jī)制尚不清楚。本研究探討CXCL4能直接抑制HDMEC增殖能力，影響多種細(xì)胞因子分泌，使血管形成能力受損，從而產(chǎn)生抗血管生成作用。有關(guān)CXCL4抗血管生成作用，仍需要更多的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Cantatore FP,Maruotti N,Corrado A,etal.Angiogenesis dysregulation in the pathogenesis of systemic sclerosis [J].Biomed Res Int,2017,2017(1):6.

[2] Kahaleh B.Vascular disease in scleroderma:mechanisms of vascular injury[J].Rheum Dis Clin North Am,2008,34(1):57-71.

[3] Silva I,Teixeira A,Oliveira J,etal.Predictive value of vascular disease biomarkers for digital ulcers in systemic sclerosis patients[J].Clin Exp Rheumatol,2015,33(4 Suppl 91):S127-S130.

[4] Asano Y,Stawski L,Hant F,etal.Endothelial Fli1 deficiency impairs vascular homeostasis:a role in scleroderma vasculopathy[J].Am J Pathol,2010,176(4):1983-1998.

[5] Riemekasten G,Philippe A,N?ther M,etal.Involvement of functional autoantibodies against vascular receptors in systemic sclerosis[J].Ann Rheum Dis,2011,70(3):530-536.

[6] Perollet C,Han ZC,Savona C,etal.Platelet factor 4 modulates fibroblast growth factor 2(FGF-2)activity and inhibits FGF-2 dimerization[J].Blood,1998,91(9):3289-3299.

[7] Sato Y,Abe M,Takaki R.Platelet factor 4 blocks the binding of basic fibroblast growth factor to the receptor and inhibits the spontaneous migration of vascular endothelial cells[J].Biochem Biophys Res Commun,1990,172(2):595-600.

[8] Gengrinovitch S,Greenberg SM,Cohen T,etal.Platelet factor-4 inhibits the mitogenic activity of VEGF121 and VEGF165 using several concurrent mechanisms[J].J Biol Chem,1995,270(25):15059-15065.

[9] van Bon L,Affandi AJ,Broen J,etal.Proteome-wide analysis and CXCL4 as a biomarker in systemic sclerosis[J].N Engl J Med,2014,370(5):433-443.

[10] Allanore Y,Simms R,Distler O,etal.Systemic sclerosis[J].Nat Rev Dis Primers,2015,15002(1):1-21.

[11] Romagnani P,Maggi L,Mazzinghi B,etal.CXCR3-mediated opposite effects of CXCL10 and CXCL4 on TH1 or TH2 cytokine production[J].J Allergy Clin Immunol,2005,116(6):1372-1379.

[12] Liu CY,Battaglia M,Lee SH,etal.Platelet factor 4 differentially modulates CD4+CD25+(regulatory)versus CD4+CD25-(nonregulatory)T cells[J].J Immunol,2005,174(5):2680-2686.

[13] Mostmans Y,Cutolo M,Giddelo C,etal.The role of endothelial cells in the vasculopathy of systemic sclerosis:A systematic review[J].Autoimmun Rev,2017,16(8):774-786.

[14] Corallo C,Cutolo M,Kahaleh B,etal.Bosentan and macitentan prevent the endothelial-to-mesenchymal transition(EndoMT)in systemic sclerosis:in vitro study[J].Arthritis Res Ther,2016,18(1):228.