林美娜 章 濤 梅序橋 許瑞元

(漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院,漳州 363000)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種病因未明的以慢性、對稱性、多關(guān)節(jié)滑膜炎和關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞為主要特征的自身免疫性疾病[1]。有研究指出，TRAIL在RA中具有雙重角色[2]，同時與TRAIL誘導(dǎo)凋亡抵抗的RAFLS和TRAIL與RA中促進(jìn)疾病活動有關(guān)。吳鳳霞等[3]研究認(rèn)為RA滑膜組織中抗凋亡分子FLIP表達(dá)增高,而且與RA滑膜炎癥程度積分相關(guān)。在多種腫瘤和炎癥反應(yīng)中，c-FLIP阻斷腫瘤壞死因子α(TNF-α)、Fas配體(FasL)和TRAIL等誘導(dǎo)的凋亡[4]。另外，臧鳳琳等[5]研究認(rèn)為c-FLIP對TRAIL生物治療具有輔助作用。

有關(guān)RA患者中凋亡相關(guān)蛋白TRAIL、c-FLIP等的研究目前多基于滑膜細(xì)胞，在外周血細(xì)胞當(dāng)中研究甚少。取材的有創(chuàng)性使得滑膜細(xì)胞的研究受到一定的限制。由于RA是一種系統(tǒng)性炎癥性疾病，其免疫病理事件涉及循環(huán)中大部分的淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等，且關(guān)節(jié)內(nèi)的活化炎癥細(xì)胞均可由外周激活的細(xì)胞池中募集而來。因此，對PBMC 的研究可能更能反映患者的整體病理狀況[6]。本研究通過分析RA患者外周血單個核細(xì)胞TRAIL、c-FLIP、caspase-8等基因的表達(dá)情況，探討其在RA中的臨床意義，為RA 的臨床診治尋找更有效的途徑和方法提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象 選擇從2014年1月至2015年6月入住漳州市醫(yī)院血液風(fēng)濕內(nèi)科的患者60例，按RA疾病活動指數(shù)(DAS28)分為低度活動期(L)組(DAS28<3.2)、中度活動期(M)組(DAS28 3.2～5.1)、高度活動期(H)組(DAS28>5.1)。其中L組22例，M組20例，H組18例。女40例，男20例，患者32～78歲，平均年齡(46.75±13.52)歲。RA的診斷標(biāo)準(zhǔn)為2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會與歐洲風(fēng)濕病學(xué)會聯(lián)合提出的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

對照(N)組為門診健康體檢者，共25例，其中女18例，男7例，31～80歲，平均年齡(45.35±14.02)歲。與RA患者相比性別、年齡構(gòu)成無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。排除其他自身免疫系統(tǒng)等疾病。

1.1.2主要試劑 促凝管(長庚醫(yī)療器械公司)；引物序列(上海生工有限公司)；Anti-TNFSF10/TRAIL Antibody(aa31-80)、Anti-CFLAR TRUEMAB Antibody Clone OTI2D3(ORIGENE)；Caspase-8 Antibody、Beclin 1 Antibody(藥明康德)；HRP標(biāo)記的抗兔二抗、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2方法

1.2.1臨床資料的收集 對60例RA患者的臨床資料進(jìn)行收集整理，包括：①患者的一般情況：性別、年齡、病程以及用藥情況；②患者病例情況：晨僵持續(xù)時間、疼痛持續(xù)時間、疼痛程度、疼痛28關(guān)節(jié)計數(shù)、疼痛總數(shù)、活動度(DAS28);③類風(fēng)濕因子RF、超敏C反應(yīng)蛋白、血沉(ESR)、抗CCP等相關(guān)輔助檢查結(jié)果信息。

1.2.2PBMC的提取和處理 分別采RA患者和健康人靜脈血2 ml，置于真空采血管中(抗凝劑)，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC[8]，一部分加入1 ml RNA 提取試劑，吹打混勻，放入-20℃冰箱過夜保存，另一部分保存用于后續(xù)試驗。

1.2.3采用熒光定量PCR檢測TRAIL、c-FLIP、caspase-8等mRNA的表達(dá) 總RNA的提取參照RNA提取試劑盒說明書。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質(zhì)量，紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。取單個核細(xì)胞經(jīng)PBS洗滌2次后，再加入1 ml Trizol混勻；加入氯仿200 μl劇烈混勻，室溫靜置5 min；4℃ 12 000 r/min離心5 min，將400 μl上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中；加500 μl預(yù)冷異丙醇，靜置10 min后，4℃ 12 000 r/min離心10 min；加入無水乙醇1 ml洗滌沉淀物，4℃ 8 000 r/min離心5 min；加入DEPC水20～80 μl，56℃助溶，總RNA經(jīng)紫外分光光度計定量OD260∶OD280≥1.8，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

RNA逆轉(zhuǎn)錄：按RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TransScript Reverse Transcriptase[M-MLV,RNaseH](Cat.No.:AT101-02)說明書操作。反應(yīng)條件：Step 1，42℃ 15 min；Step 2，85℃ 5 s。得到的cDNA放置-20℃冰箱中備用，或者立即用于Real-time qPCR反應(yīng)。Real-time qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的優(yōu)化，采用北京全式金生物技術(shù)有限公司(TransGen)熒光定量PCR試劑盒2×TransStarTMTop Green qPCR SuperMix(Cat.No.:AQ131-02)進(jìn)行Real-time qPCR試驗，優(yōu)化Real-time qPCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件，確定最佳的模板濃度、退火溫度，確保PCR引物的特異性及PCR擴(kuò)增效率(引物見表1)。

優(yōu)化Real-time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系及反應(yīng)條件后，進(jìn)行正式試驗。Real-time qPCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(見表2) 要在冰上進(jìn)行配制。每個反應(yīng)重復(fù)3次，配制反應(yīng)體系時先配制總的反應(yīng)液，再各個分裝。選擇Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀進(jìn)行定時定量PCR反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參基因，2-ΔΔCt法分析基因表達(dá)水平，比較各基因在不同組織樣本中的表達(dá)差異，得到表達(dá)差異分析結(jié)果。

1.2.4Western blot檢測TRAIL、FADD、caspase-8的表達(dá)水平 外周血單個核細(xì)胞總蛋白的提?。篜BMC細(xì)胞,用1×PBS 洗2次后，加入400 μl含蛋白酶抑制劑 cooktail的RIPA 強(qiáng)裂解液，冰上充分裂解15 min；將裂解液移入1.5 ml離心管，用超聲細(xì)胞裂解器在冰上裂解；將液體移入1.5 ml離心管，4℃ 12 000 r/min離心15 min；取上清移入另一新的離心管；BCA法進(jìn)行蛋白定量；蛋白樣品加入1/4體積上樣緩沖液，沸水煮 5 min，蛋白電泳。

Western blot流程：取蛋白樣品各30 μg，用10% SDS-PAGE凝膠將提取的總蛋白分離，120 V條件下電泳約 90 min；將膠上的蛋白條帶利用濕式轉(zhuǎn)膜法電轉(zhuǎn)移至NC膜上，恒壓100 V，冰浴中轉(zhuǎn)120 min；取出NC膜，麗春紅染色，觀察轉(zhuǎn)移效果后用 5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜5 min；一抗稀釋液稀釋1∶1 000，含適當(dāng)稀釋一抗的塑料袋中封膜，4℃搖床孵育冰箱過夜，TBST洗膜 5 min，3 次；TBST稀釋二抗1∶5 000，含適當(dāng)稀釋二抗的塑料袋中封膜，室溫?fù)u床孵育 1 h，TBST洗膜 5 min，3 次；將膠片進(jìn)行掃描，用南京馳順科技發(fā)展有限公司的GIS300凝膠成像分析系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和光密度相對比值。

2 結(jié)果

2.1各組RA患者PBMC TRAIL、c-FLIP、caspase-8 mRNA表達(dá)情況(見表3、圖1) RA患者PBMC中中M組TRAIL mRNA為3.26±0.78，明顯高于N組1.30±0.20 (P=0.028)，L組和H組 (1.56±0.37、1.83±0.26) 略高于N組(P=0.048、0.043)；L、M、H組中c-FLIP的mRNA相對表達(dá)量分別為1.27±0.28、1.32±0.34、1.93±0.40，均高于N組(1.08±0.12)，P分別為0.035、0.034、0.030，均小于0.05，有顯著性差異；L、M、H組中caspase-8的mRNA分別為2.77±0.97、4.52±0.85、2.13±0.44，均高于N組1.04±0.13，P分別為0.023、0.012、0.032，均小于0.05，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。M組水平較L、H組高(P=0.037、0.029)。

表1Real-timeqPCR反應(yīng)引物(引物序列5′→3′)

Tab.1Real-timefluorescencequantitativePCRprimer(Primersequence5′→3′)

GeneForwardprimerReverseprimerTRAILCCCAATGACGAAGAGAGTATGAACTGTAGAAATGGTTTCCTCAGAGGTc?FLIPTTTACCACCCAGAGACACGCAGAACCTCTGCCTGCTGAACCaspase?8TGATGAAGAGGCTCTGAGTAATGGCAAAGTGACTGGATATAGAPDHAATGAAGGGGTCATTGATGGAAGGTGAAGGTCGGAGTCAA

表2實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

Tab.2Real-timefluorescencequantitativePCRreactionsystem

ComponentsVolume(μl)2×TransStarTMTopGreenqPCRSuperMix100Forwardprimer(10μmol/L)04Reverseprimer(10μmol/L)04cDNAtemplate20ddH2OUpto20

表3RA患者PBMCTRAIL、c-FLIP、caspase-8的mRNA表達(dá)情況

Tab.3mRNAexpressionofPBMCTRAIL,C-FLIPandcaspase-8inRApatients

GroupsTRAILmRNAc?FLIPmRNACaspase?8mRNAN130±020108±012104±013L156±0371)2)127±0281)277±0971)2)M326±0781)132±0341)452±0851)H183±0261)2)193±0401)2)213±0441)2)

Note：Compare with group N,1)P<0.05;compare with group M,2)P<0.05.

圖1 TRAIL、c-FLIP、caspase-8 mRNA相對表達(dá)情況Fig.1 Relative expression level of TRAIL,c-FLIP and caspase-8 mRNA

圖2 TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)情況Fig.2 Protein expression of TRAIL,c-FLIP and caspase-8

圖3 TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白相對表達(dá)量Fig.3 Relative expression of TRAIL,c-FLIP and caspase-8 protein

2.2RA患者PBMC TRAIL、c-FLIP、caspase-8蛋白表達(dá)變化(見圖2、3) RA患者PBMC中TRAIL蛋白M組明顯高于N組(P=0.013 ),H組稍高于N組(P=0.043),L組與N組差異無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.058),M組明顯高于L、H組(P=0.011,0.021)；c-FLIP蛋白M組表達(dá)顯著高于N組(P=0.001), L、 H組與N組比較， 差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.062,0.053)；caspase-8蛋白表達(dá) M、H組明顯高于N組(P=0.003,0.001)；L組與N組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.072)。

3 討論

RA是關(guān)節(jié)滑膜慢性炎癥為主的自身免疫性疾病，致殘率高[9]。RA發(fā)生發(fā)展是一個多因素參與的復(fù)雜過程，RA發(fā)病機(jī)制的研究一直處在不斷發(fā)展中。RA關(guān)節(jié)軟骨和骨組織的損害，與滑膜細(xì)胞的過度增生活化與凋亡不足有關(guān)，凋亡機(jī)制在RA發(fā)病中占重要地位[10]。對于RA患者細(xì)胞的相關(guān)研究,NaKajima和Firestein 首先報道了RA滑膜細(xì)胞表達(dá)fas抗原,且fas抗體可誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞凋亡[11]。也有研究表明，TRAIL及其受體在T細(xì)胞的表達(dá)分布可能是RA發(fā)病機(jī)制的重要啟示[12]。

TRAIL共有5種受體，包括死亡受體4(DR4 )、死亡受體5(DR5) 、誘騙受體1(DcRI) 、誘騙受體2(DcR1) 和可溶性受體骨保護(hù)素。其中DR4、DR5屬于死亡受體，因這兩種受體均含有胞內(nèi)死亡結(jié)構(gòu)域和依賴caspase系統(tǒng)的凋亡命令的識別結(jié)構(gòu)域，TRAIL與DR4或DR5受體結(jié)合后將TRAIL的死亡信息傳遞至細(xì)胞內(nèi)，通過進(jìn)一步激活caspase系統(tǒng)，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。本研究RA外周血單個核細(xì)胞TRAIL mRNA中L、M、H三個活動組均顯著高于N組，且M組又顯著高于 L、H組。TRAIL蛋白表達(dá)中M、H組均明顯高于N組，L組與N組差異無統(tǒng)計學(xué)意義；M組明顯高于L、H組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。在不同RA組別中TRAIL mRNA及蛋白表達(dá)總體趨勢增高，而M組呈明顯高表達(dá)，這可能與RA不同活動期不同程度的凋亡抑制的代償體現(xiàn)有關(guān)。

細(xì)胞型Fas 相關(guān)死亡域樣IL-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白(c-FLIP)是外部凋亡通路中的一個重要負(fù)調(diào)控因子。c-FLIP蛋白在結(jié)構(gòu)與序列上與caspase-8 有很多相似之處,其N-端含有與caspase-8 相似的兩個相互串聯(lián)的DED 。研究認(rèn)為c-FLIP通過其caspase 同源結(jié)構(gòu)域與caspase-8 相互靠近形成異二聚體c-FLIP(L)/caspase-8，使得c-FLIP 競爭性結(jié)合FADD，抑制DISC的形成，阻礙TRAIL誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。本研究外周血單個核細(xì)胞中c-FLIP mRNA L、M、H組分別高于N組(P=0.035，0.034，0.030)。c-FLIP基因mRNA水平在RA患者不同活動程度的外周血單個核細(xì)胞中呈遞進(jìn)性升高，且與疾病的進(jìn)程呈正相關(guān)。這表明c-FLIP這一凋亡抑制要素在RA患者中的存在，其mRNA水平與RA患者不同活動程度的相關(guān)性可在外周血單個核細(xì)胞中體現(xiàn)，方便為RA病情評估提供參考。c-FLIP蛋白與c-FLIPmRNA表達(dá)不那么同步，M組c-FLIP蛋白表達(dá)明顯高于其他組別。L、H組與正常對照表達(dá)差異不大(P=0.062，0.053)。原因有待進(jìn)一步探討，這可能是c-FLIP存在轉(zhuǎn)錄環(huán)節(jié)的調(diào)節(jié)，或是c-FLIP在滑膜細(xì)胞與外周血細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄差異，或是本實驗中對RA患者收集的病例數(shù)量有限造成的誤差所致。本研究caspase-8 mRNA中，L、M、H組也均高于N組(P=0.023，0.012，0.032)。caspase-8蛋白表達(dá)中，L組與N組比較，無顯著性差異(P=0.072)；M、H組明顯高于N組(P=0.003,0.001)。caspase-8總體水平增高，有可能由于c-FLIP通過其caspase 同源結(jié)構(gòu)域與caspase-8 相互靠近形成異二聚體c-FLIP(L)/caspase-8，使得增高的caspase-8不能結(jié)合到DISC上,從而不能有效活化，引起下級caspase 酶系的級聯(lián)反應(yīng)。

TRAIL具有強(qiáng)大的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的能力，但對正常細(xì)胞基本沒有影響。體內(nèi)、體外實驗表明，TRAIL可選擇性地誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞等多種腫瘤細(xì)胞及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的凋亡；對荷瘤動物應(yīng)用外源性的TRAIL，結(jié)果顯示腫瘤生長速度顯著降低，對荷瘤動物本身無明顯的副作用[14]。RA的特征之一就是滑膜組織表現(xiàn)為增生性侵蝕性生長,其生長性質(zhì)和病理學(xué)行為在許多方面類似于腫瘤組織的特性,對軟骨組織造成進(jìn)行性破壞。因此延緩甚至抑制滑膜細(xì)胞異常增殖與誘導(dǎo)其凋亡將成為治療RA的主要策略之一,具有十分重要的意義[15]。近幾年，有關(guān)TRAIL或TRAIL相關(guān)制劑應(yīng)用于RA的治療已有一些研究。陳金[16]研究發(fā)現(xiàn)重組人腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(hTRAIL)可體外誘導(dǎo)RASFs凋亡。周劍鎖等[17]研究發(fā)現(xiàn)EPB可以上調(diào)死亡受體DR4、DR5,增強(qiáng)FLS對TRAIL和AD5-10的敏感性,從而為RA治療提供了新的策略。

臧鳳琳等[5]認(rèn)為c-FLIP很可能是TRAIL治療腫瘤的選擇性標(biāo)志物，即對TRAIL 耐藥的腫瘤細(xì)胞首先要檢測c-FLIP 表達(dá)水平。如果c-FLIP 高表達(dá)，可以應(yīng)用特異性降低c-FLIP聯(lián)合TRAIL的方法；如果c-FLIP低表達(dá)，說明TRAIL對該腫瘤治療無效，需要改換其他治療手段。本研究RA患者外周血單個核細(xì)胞中，腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體TRAIL、c-FLIP、caspase-8等基因表達(dá)水平總體趨勢增加，有望為TRAIL或TRAIL相關(guān)制劑應(yīng)用于RA治療或其他RA臨床診治的后續(xù)研究提供實驗參考。

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