常聰，張安，程述敏，張文學(xué)

(四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065)

紅曲是以大米為發(fā)酵基質(zhì)，接種紅曲霉菌，經(jīng)發(fā)酵而得的一種色澤為紫紅色的產(chǎn)物[1]。我國對紅曲霉的應(yīng)用歷史悠久。紅曲霉代謝產(chǎn)物繁多[2]，而紅曲色素和Monacolin K是2種重要的代謝產(chǎn)物[3]。紅曲色素作為天然優(yōu)質(zhì)食用色素，具有抗突變、防腐等作用[4,5]，在食品、醫(yī)藥等行業(yè)應(yīng)用較廣；Monacolin K能抑制人體膽固醇合成[6]，被認(rèn)為是最佳的血脂調(diào)節(jié)物。目前國內(nèi)外以同時提高二者產(chǎn)量為目的的誘變育種研究較少，而我國工業(yè)化生產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K普遍存在成本高、產(chǎn)量低的問題，因此提高紅曲霉菌株發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的能力具有重要的現(xiàn)實意義。誘變育種是利用合理有效的誘變劑及誘變劑量處理微生物的單細(xì)胞，提高突變頻率，再通過適當(dāng)?shù)暮Y選方法獲得優(yōu)質(zhì)菌株的育種方法[7]。因此，文章采用對紅曲霉單孢子懸液進(jìn)行紫外線-氯化鋰的復(fù)合誘變方法，對平板菌落初篩，對紅曲色素、Monacolin K含量檢測進(jìn)行復(fù)篩，并進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性實驗，旨在篩選出同時高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K及具備良好遺傳穩(wěn)定性的紅曲霉突變菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌種

從本實驗室、中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)、中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)共購買收集5株紅曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)。

1.1.2 培養(yǎng)基

1.1.2.1 種子液培養(yǎng)基

馬鈴薯20%，無水葡萄糖2%，自然pH，121 ℃滅菌20 min。

1.1.2.2 大米培養(yǎng)基

大米經(jīng)清洗，于水中浸泡1 h，瀝干水分，進(jìn)行蒸煮至大米顆粒分散、微粘狀態(tài)。蒸煮后的大米分別取30 g分裝于250 mL三角瓶中，121 ℃，0.1 MPa滅菌20 min。

1.1.3 主要試劑

色譜純：甲醇、磷酸；分析純：甲醇、無水葡萄糖、無水乙醇、無水氯化鋰。

1.1.4 主要儀器設(shè)備

單人雙面凈化工作臺、立式壓力蒸汽滅菌鍋、臺式高速冷凍離心機、高效液相色譜儀、電熱恒溫真空干燥箱、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、電子天平、磁力攪拌器、超聲清洗機、可調(diào)萬用電爐、電磁爐、蒸鍋、40目篩等。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅曲米制作方法

1.2.1.1 種子液

將紅曲霉斜面孢子刮下置于三角瓶中，振蕩充分，無菌脫脂棉過濾孢子液，將孢子稀釋至濃度約為 106～107個/mL，即為孢子懸液，2%接種量接種于種子液培養(yǎng)基中，120 r/min搖床28 ℃培養(yǎng)48 h。

1.2.1.2 固態(tài)發(fā)酵紅曲米

將種子液按照10%(V/V)接種量接種于裝有30 g大米培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，并用無菌玻璃棒打散，于28 ℃培養(yǎng)14天。

1.2.2 紅曲中Monacolin K的檢測方法[8，9]

將紅曲發(fā)酵產(chǎn)物于40 ℃下烘干研磨至40目，稱取0.5 g于50 mL容量瓶中，加入適量無水甲醇，室溫下超聲1 h，中間間歇振蕩3～4次最終定容到50 mL。以4000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min。取上清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，濾液取20 μL經(jīng)HPLC測定方法檢測，并根據(jù)HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線計算內(nèi)酯式及酸式Monacolin K含量，并計算Monacolin K總含量。HPLC檢測方法參考QB/T 2847-2007。

1.2.3 紅曲中紅曲色素的檢測方法[10]

紅曲色素提取及檢測方法參考GB 1886.19-2015。

稱取0.2 g烘干研磨后的紅曲發(fā)酵產(chǎn)物，用70%乙醇溶液溶解并將其轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，定容，置于(60±0.5) ℃水浴中，浸泡1 h，冷卻至室溫，補充70%乙醇溶液至刻度，混勻后過濾，吸取一定體積的濾液于50 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液稀釋定容至50 mL，搖勻，在505 nm的波長下測定處理后樣品的吸光度A，并計算樣品的色價。

式中：A為樣品吸光度；m1為樣品質(zhì)量(g)；V為吸取乙醇浸泡液的體積(mL)。

1.2.4 紅曲霉菌株產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K能力的測定

對5株紅曲霉(QH，JP2，5046，40225，40938)的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行Monacolin K和紅曲色素的提取及檢測。比較5株紅曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K能力，選擇最優(yōu)紅曲霉菌株作為后續(xù)實驗菌株。

1.2.5 誘變方法

1.2.5.1 紫外誘變

在避光的無菌操作臺中，將裝有5 mL制備好的單孢子懸浮液的無菌培養(yǎng)皿放置于磁力攪拌器上，將滅過菌的攪拌轉(zhuǎn)子放置于培養(yǎng)皿中，開啟攪拌器，使單孢子懸浮液一直保持?jǐn)嚢锠顟B(tài)，在紫外燈(25 W)下，保持垂直照射距離20 cm，將培養(yǎng)皿分別照射1，2，3，4，5 min。避光下將不同紫外誘變劑量的單孢子菌懸液分別稀釋至10-3，取各誘變后的單孢子菌懸液及其稀釋液0.1 mL涂平板，每個樣品做3個平行。未經(jīng)誘變的原菌液稀釋同等梯度涂平板作為空白對照。平板靜置20 min后于28 ℃恒溫培養(yǎng)室中倒置培養(yǎng)3天左右，避光培養(yǎng)，以免發(fā)生光復(fù)活作用。待菌落生長出來觀察并記數(shù)，計算致死率。一般來說，為了提高誘變成功率，應(yīng)采取較高致死率的平板菌落繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實驗，但過高致死率平板上的突變菌株容易發(fā)生回復(fù)突變的情況，性狀不穩(wěn)定。因此，選取致死率在70%～80%的平板的誘變劑量作為最佳誘變劑量。

式中：A為對照組菌落數(shù)；B為誘變組菌落數(shù)。

1.2.5.2 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變

將上述紫外誘變后的孢子懸浮液分別吸取0.1 mL涂布于氯化鋰濃度分別為0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰的PDA平板上，每個梯度3個平行，并以不含氯化鋰的PDA平板作為對照組。將以上PDA平板于28 ℃恒溫培養(yǎng)室倒置培養(yǎng)3天。觀察并記錄菌落數(shù)，計算不同誘變劑量的致死率。

1.2.5.3 突變菌株篩選方法

初篩方法：以原始菌株菌落形態(tài)作為對照，選取最佳誘變劑量下的誘變菌落中，菌落直徑、菌落顏色、菌絲疏密程度等與原始菌落有區(qū)別者，進(jìn)行平板劃線分離，獲得突變單菌落。

復(fù)篩方法：初篩得到的單菌落接種于斜面PDA培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)7天后轉(zhuǎn)入種子液培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天后，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)14天，檢測發(fā)酵產(chǎn)物中紅曲色素和Monacolin K的含量，篩選出高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的突變菌株。

1.2.5.4 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

將紫外-氯化鋰復(fù)合誘變處理后，篩選得到的高產(chǎn)Monacolin K紅曲霉突變菌株轉(zhuǎn)接至斜面PDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天后作為第1代，第1代斜面菌落轉(zhuǎn)接至新的斜面PDA培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)7天后為第2代，以此類推到第5代。每一代的紅曲菌株都需進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵14天后檢測紅曲色素和Monacolin K的含量，篩選出遺傳穩(wěn)定性最高的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅曲霉菌株產(chǎn)Monacolin K能力的測定

對5株初始紅曲霉菌株(QH，JP2，5046，40225，40938)紅曲色素和Monacolin K產(chǎn)量進(jìn)行測定，見表1。

表1 5株初始紅曲霉紅曲色素色價和Monacolin K含量Table 1 Levels of Monascus pigments and Monacolin K in 5 original Monascus strains

注：“—”為未檢出。

其中紅曲霉QH的紅曲色素相對較高，色價達(dá)1330 U/g，Monacolin K產(chǎn)量最高，為0.36 mg/g。后續(xù)將選用該菌株作為原始菌株，進(jìn)行復(fù)合誘變育種高產(chǎn)Monacolin K菌株。

2.2 最佳誘變條件的確定

通過平板菌落計數(shù)，計算不同誘變劑量下的紅曲霉菌致死率，制作誘變劑量與致死率的相關(guān)曲線，從而確定紫外-氯化鋰的最佳復(fù)合誘變條件。

2.2.1 紫外誘變劑量的選擇

圖1 紫外誘變時間對紅曲霉菌QH致死率的影響Fig.1 Effect of ultraviolet mutation duration on the lethal rate of Monascus QH

由圖1可知，紫外誘變劑量達(dá)到2 min時，紅曲菌致死率達(dá)到75%，所以確定2 min為紫外誘變的最佳誘變劑量。

2.2.2 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變劑量的選擇

圖2 氯化鋰濃度對紅曲霉菌QH致死率的影響Fig.2 Effect of LiCl concentration on the lethal rate of Monascus QH

由圖2可知，氯化鋰濃度達(dá)到0.6‰時，紅曲霉菌致死率達(dá)到78%，所以確定氯化鋰濃度為0.6‰作為復(fù)合誘變處理劑量。

2.2.3 紫外-氯化鋰復(fù)合誘變篩選結(jié)果

2.2.3.1 誘變菌株初篩

選取最佳誘變劑量——紫外誘變2 min、氯化鋰濃度0.6‰的平板菌落作為誘變菌落，誘變前后的紅曲霉菌菌落形態(tài)對比見圖3。

圖3 誘變前后紅曲霉菌落形態(tài)對比Fig.3 Colonial morphology of Monascus before and after mutation

注：左表示未經(jīng)誘變，右表示紫外-氯化鋰復(fù)合誘變后。

由圖3可知，紫外-氯化鋰復(fù)合誘變后的菌落形態(tài)與原始菌落形態(tài)有一定差別：誘變后的菌落直徑較大，且邊緣白色菌絲所占面積較未經(jīng)誘變的菌落小，而中心橙紅色部分菌絲所占面積較未經(jīng)誘變的菌落大。挑選與原始菌落差別較大的單菌落進(jìn)行平板劃線分離及PDA斜面保藏。

2.2.3.2 誘變菌株復(fù)篩

經(jīng)菌落形態(tài)初篩，獲得紫外-氯化鋰復(fù)合誘變菌株50株，編號為QH1～QH50，分別對其進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵并測定發(fā)酵產(chǎn)物中紅曲色素和Monacolin K的含量，檢測其是否高于原始菌株QH的色素和Monacolin K產(chǎn)量，若高于原始菌株QH則為正突變。50株紅曲霉誘變菌株的代謝能力不一，有的突變株產(chǎn)量提高，有的突變株產(chǎn)量降低。紅曲色素和Monacolin K產(chǎn)量同時提高最多的突變菌株見表2。

表2 誘變菌株QH12，QH14，QH46 紅曲色素和Monacolin K含量及提高值

由表2可知，突變株QH12，QH14，QH46的紅曲色素及Monacolin K產(chǎn)量較原始菌株均有所提高，紅曲色素色價分別達(dá)到2450，3190，1960 U/g，是原始菌株的1.84，2.40，1.47倍；Monacolin K分別達(dá)到1.68，1.28，1.99 mg/g，是原始菌株的4.67，3.56，5.53倍，可見紫外-氯化鋰復(fù)合誘變紅曲菌株的產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K能力好。

2.2.4 誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性實驗

誘變后的突變菌株性狀不穩(wěn)定，培養(yǎng)過程中會出現(xiàn)突變性狀衰退甚至消失，從而不能應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)，故要對突變菌株進(jìn)行傳代穩(wěn)定性試驗。對3株紅曲菌突變株QH12，QH14，QH46分別連續(xù)傳代4次，進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵實驗并檢測其紅曲色素和Monacolin K產(chǎn)量，每次3個平行，取平均值，結(jié)果見表3。

表3 紅曲霉菌誘變菌株產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的情況Table 3 Production of Monascus pigments and Monacolin K in mutant strains

由表3可知，突變株每次傳代后的紅曲色素和Monacolin K產(chǎn)量均低于第1代突變株，降低幅度不定。兩種產(chǎn)物綜合考慮，其中QH12突變株降幅均較小，遺傳性能比較穩(wěn)定，因此選擇該菌株作為繼續(xù)研究的菌株。

方春玉等[11]采用物理(紫外、超聲波、微波)誘變和化學(xué)(氯化鋰)誘變相結(jié)合的方式對紅曲進(jìn)行誘變，誘變菌株產(chǎn)紅曲色素的能力提高了約3倍。孫嘉龍等[12]采用紫外線照射45 s、氯化鋰1.0‰的誘變劑量對紅曲菌株進(jìn)行復(fù)合誘變，篩選出高產(chǎn)Monacolin K的紅曲突變菌株，其Monacolin K產(chǎn)量是原始菌株Monacolin K含量的3.3倍，且連續(xù)傳接4代Monacolin K產(chǎn)量穩(wěn)定。羅定軍等[13]將Monacolin K產(chǎn)生菌采用紫外線(UV)和氯化鋰(LiCl)對其原生質(zhì)體進(jìn)行復(fù)合誘變，經(jīng)原生質(zhì)體再生，獲得高產(chǎn)菌株BTL23，BTL56，Monacolin K的產(chǎn)量比原來提高23.3%，并將高產(chǎn)菌株BTL23成功用于紅曲Monacolin K的實際生產(chǎn)。而本研究采用紫外誘變2 min、氯化鋰濃度0.6‰對紅曲霉菌株QH進(jìn)行復(fù)合誘變，得到高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K且遺傳性能穩(wěn)定的突變菌株QH14，與以上研究結(jié)論有異曲同工之處，故說明采用紫外-氯化鋰對紅曲霉菌株進(jìn)行復(fù)合誘變是合理、有效、有依據(jù)的。

3 結(jié)論

本文對5株原始紅曲霉菌產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的能力進(jìn)行測定，其中紅曲霉QH的紅曲色素較高，Monacolin K產(chǎn)量最高，對其進(jìn)行紫外-氯化鋰復(fù)合誘變篩選高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K的突變菌株。得到最佳誘變條件：紫外誘變時長2 min，氯化鋰濃度0.6‰。經(jīng)過菌落形態(tài)初篩，紅曲色素和Monacolin K含量檢測復(fù)篩，以及遺傳穩(wěn)定性實驗，得到了高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K且遺傳穩(wěn)定性能好的突變菌株QH12，其紅曲色素色價達(dá)到2450 U/g，是原始菌株的1.84倍；Monacolin K產(chǎn)量達(dá)到1.68 mg/g，是原始菌株QH的4.67倍，兩種代謝產(chǎn)物較原始菌株均有所提高。本文為高產(chǎn)紅曲色素和Monacolin K工程菌株提供了有效的菌種資源，對紅曲中色素和Monacolin K的學(xué)術(shù)研究具有意義。

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