羅新新+朱水蘭+李冰濤+史秀明+涂珺

[摘要] 該實驗研究復(fù)方葛根芩連湯體內(nèi)外改善脂肪胰島素抵抗（IR）的藥效及相關(guān)分子機制。采用高糖高脂飲食加小劑量鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病大鼠模型，葛根芩連湯給藥干預(yù)3個月，檢測糖尿病大鼠空腹血糖、胰島素和糖化血清蛋白，計算胰島素抵抗指數(shù)。提取大鼠脂肪組織總RNA，qPCR檢測糖尿病大鼠過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）、脂聯(lián)素（ADPN）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（GLUT4）、葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（GLUT2）、乙酰輔酶A羧化酶α基因（ACACA）和乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB）基因mRNA表達水平。1 μmol·L-1地塞米松誘導(dǎo)建立穩(wěn)定IR-3T3-L1脂肪細胞模型，CCK-8法檢測葛根芩連湯含藥血清對細胞活力的影響，采用5%，10%，15%葛根芩連湯含藥血清干預(yù)24 h檢測細胞培養(yǎng)液葡萄糖含量、游離脂肪酸（NEFA）含量和外泌脂聯(lián)素含量，測定細胞內(nèi)甘油三酯（TG）含量。熒光定量qPCR和Western blot分別檢測IR-3T3-L1細胞PPARγ，ADPN和GLUT4 mRNA和蛋白質(zhì)表達水平。結(jié)果顯示葛根芩連湯給藥3個月可明顯降低糖尿病大鼠的空腹血糖、胰島素和糖化血清蛋白（P<0.01），下調(diào)胰島素抵抗指數(shù)（P<0.05），具有較好的降糖效果。葛根芩連湯可顯著升高糖尿病大鼠脂肪組織PPARγ，ADPN，GLUT4，GLUT2，ACACA和ACACB基因mRNA表達水平。5%，10%，15%葛根芩連湯含藥血清均可顯著性上調(diào)IR-3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量（P<0.01）；降低IR-3T3-L1細胞TG含量（P<0.01）；一定程度下調(diào)NEFA含量但并不顯著。此外，葛根芩連湯含藥血清劑量依賴上調(diào)外泌ADPN，15%含藥血清上調(diào)ADPN非常顯著 （P<0.01）；各劑量含藥血清顯著上GLUT4表達（P<0.01）。該研究顯示葛根芩連湯激活PPARγ上調(diào)ADPN和GLUT4調(diào)節(jié)糖代謝改善脂肪IR。

[關(guān)鍵詞] 葛根芩連湯； 脂肪胰島素抵抗； 3T3-L1脂肪細胞； 過氧化物酶體增殖物激活受體γ； 脂聯(lián)素； 葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4

[Abstract] To investigate the effects of Gegen Qinlian decoction（GQD） in improving adipocytic insulin resistance（IR） and explore its related molecular mechanism. Diabetic rats models were induced by high glucose and high-fat diet with a small dose of streptozotocin， and after GQD treatment for 3 months， blood biochemical indexes such as fasting blood-glucose（FBG）， insulin， glycosylated serum protein（GSP） and HOMA-IRI were detected and assessed. After the total RNA was extracted from the adipose tissue of diabetic SD rats， PPARγ， ADPN， GLUT4， GLUT2， ACACA and ACACB mRNA expression levels were separately detected by qPCR. Then， stable IR-3T3-L1 adipocyte model was built with 1 μmol·L-1dexamethasone. After the cell viability was detected by CCK-8 assay， 5%， 10% and 15% GQD-containing serum（GQD-CS） were respectively used to treat IR-3T-L1 adipocytes for 24 h. The contents of glucose， nonesterified fatty acid（NEFA） and adiponectin in cell culture supernatants were separately detected whereas the intracellular triglyceride（TG） contents of IR-3T3-L1 adipocytes were also measured. The ADPN， PPARγ and GLUT4 mRNA and protein expression levels were respectively detected by qPCR and Western blot in IR-3T3-L1 adipocytes. Results showed that GQD significantly decreased fasting blood glucose， insulin and GSP（P<0.01）， and down-regulated HOMA-IRI（P<0.05） after the high-fat diet/streptozotocin-induced diabetic SD rats were treated for three months， with a good hypoglycemic effect. Moreover， PPARγ， ADPN， GLUT4， GLUT2， ACACA and ACACB mRNA expression levels were significantly elevated in the adipose tissue of GQD-treated diabetic SD rats. The 5%， 10% and 15% GQD-CS significantly increased glucose consumption of IR-3T3-L1 adipocytes at 24 h treatment（P<0.01）， significantly decreased the intracellular TG content （P<0.01）， and down-regulated NEFA to a certain extent but not significantly. Moreover， GQD-CS significantly up-regulated GLUT4 and ADPN expression. The results indicated that GQD could activate PPARγ to ameliorate adipocytic insulin resistance in the diabetic SD rats and IR-3T3-L1 adipocytes.endprint

[Key words] Gegen Qinlian decoction； adipocytic insulin resistance； 3T3-L1 adipocytes； peroxisome proliferators-activated receptor γ； adiponectin； glucose transporter 4

2型糖尿?。═2DM）屬于中醫(yī)“消渴病”范疇，被認為是與脾胃虛損最相關(guān)的本虛標實之證[1]。在T2DM中醫(yī)證型臨床研究發(fā)現(xiàn)，濕熱困脾T2DM患者多源于高脂飲食，在溫暖潮濕的南方發(fā)病率更高，多伴有胰島素抵抗（IR），且癥狀越嚴重，IR指數(shù)越高。血脂代謝紊亂在濕熱困脾患者IR發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[2]。仝小林教授等根據(jù)中醫(yī)“異病同治”思想，運用葛根芩連湯組方于濕熱困脾型糖尿病中取得良好的臨床療效，目前積累了大量臨床有效案例[3-4]。葛根芩連湯源自漢代名醫(yī)張仲景的《傷寒論》，始用于治療急性腹瀉，組方符合“胃腸濕熱癥”的病機，與臨床中常見的T2DM“濕熱困脾證”病機相似，且方中葛根、黃連、黃芩據(jù)古今文獻記載均有治消渴的功效。動物實驗發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯可以有效減輕IR治療糖尿病[5]?？紤]到脂肪組織是率先發(fā)生IR的部位，對糖尿病發(fā)生發(fā)展起著重要作用。以往體外研究多集中葛根芩連湯干預(yù)肝IR和骨骼肌IR上，迄今為止對于葛根芩連湯改善脂肪IR的體內(nèi)外效用機制研究較少。本課題組擬在研究糖尿病Sprague Dawley（SD）大鼠脂肪組織基礎(chǔ)上結(jié)合體外IR-3T3-L1脂肪細胞研究探討葛根芩連湯調(diào)節(jié)糖脂代謝改善脂肪IR的分子作用機制。

1 材料

1.1 動物 體內(nèi)實驗SPF級雄性SD大鼠由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，合格證號HNASLKJ20121354。體外實驗SPF級雄性SD大鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號11400700119627。

1.2 細胞株 3T3-L1小鼠前脂肪細胞株，購于美國模式培養(yǎng)物收集中心（ATCC），批號62996847。

1.3 藥材 葛根（野葛，批號150929，產(chǎn)地河南，江中飲片廠）、炙甘草（批號910018，產(chǎn)地內(nèi)蒙古，亳州市中信中藥飲片廠）、黃連（批號905024，產(chǎn)地四川，江西樟樹天齊堂中藥飲片有限公司）、黃芩（批號911002，產(chǎn)地北京，亳州市中信中藥飲片廠）。藥材均符合2015年版《中國藥典》一部規(guī)定。

1.4 試劑 鹽酸二甲雙胍片（上海信誼藥廠有限公司，批號100916）；鏈脲佐菌素（Sigma公司，批號08/2013）；3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX，Sigma公司，批號15879）；地塞米松（Sigma公司，批號822A0521）；胰島素（Sigma分裝，批號Y0001717）；羅格列酮（Sigma公司，批號R2408）；葡萄糖測定試劑盒、甘油三脂（triglyceride，TG）測定試劑盒和游離脂肪酸（nonesterified fatty acid，NEFA）測定試劑盒（南京建成生物有限公司，批號分別為20160509，20160531，21060704）；糖化血清蛋白（glycosylated serum protein，GSP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒（美國TSZ，批號201302）；RNeasy liquid tissue Mini Kit（Qiagen公司，批號74804）；mirVanaTMmiRNA Isolation Kit（Ambion公司，批號1406120）；TRIzol Reagent（Life technologies公司，批號87806）；GoScriptTM Reverse Transcription System （Promega Corporation公司，批號0000120448）；Power SYBR Green PCR Master Mix （Life technologies公司，批號1509007）；Nuclease-Free water（Promega Corporation公司，批號#0000070302）；脂聯(lián)素（adiponectin，ADPN） ELISA Kit （Invitrogen公司，批號V24037929）；M-PERTM Mammalian Protein Extraction Reagent（Pierce 公司，批號#QL226664）；β-肌動蛋白（β-actin）抗體（Cell Signaling Technology公司，批號#4970）；過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）抗體（Cell Signaling Technology公司，批號#2435）；ADPN抗體（Cell Signaling Technology公司，批號#2789）；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白2（glucose transporter 2，GLUT2）抗體（Abcam公司，批號#ab921599）；葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白4（glucose transporter 4，GLUT4）抗體（Invitrogen公司，批號#RD2186733）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（Invitrogen公司，批號#RB230194）；HaltTMProtease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（Thermo Scientific公司，批號#PK207574）；PVDF膜（美國Millipore公司，批號#KIMA4925DK）；30%丙烯酰胺（Bio-Rad公司，批號#161-0156）；TEMED（Bio-Rad公司，批號#161-0800）；脫脂奶粉（BD公司，批號4143846）；ClarityTM Western ECL Substrate（Bio-Rad公司，批號#102030693）。endprint

1.5 儀器 色譜柱Shim-pack XR-ODSⅢ（2.0 mm×7.5 mm，1.6 μm，Shimadzu HPLC packed column）；三重四級桿質(zhì)譜儀ABQ-TRAP5500；倒置顯微鏡（Olymplus CKX41）；臺式高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號Centrifuge 5424R）；全波長酶標儀（Spectra Max Plus384，Molecular Devices）；電泳儀、垂直電泳槽（Bio-Rad）；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（Bio-Rad）。

2 方法

2.1 糖尿病SD大鼠的制備及分組給藥 選用120～150 g SD雄性大鼠，無菌潔凈（SPF）環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機取10只作為正常對照組，喂以普通飼料，其他大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周。禁食12 h后稱重，按25 mL·kg-1尾靜脈一次注射檸檬酸緩沖溶液新鮮配制的鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病SD大鼠模型，正常對照組注射同等劑量的檸檬酸緩沖溶液。造模成功的判斷標準：各大鼠均于注射72 h和1周后尾尖取血測空腹血糖（FBG），2次血糖值均大于11.1 mmol·L-1，結(jié)合大鼠的飲水量和尿量等癥狀判定為造模成功。

將造模成功的大鼠以FBG為因素，隨機分成3組，分別為模型組、陽性二甲雙胍組、葛根芩連湯組，每組10只。正常組和糖尿病模型組給予等體積的生理鹽水；陽性藥組給藥鹽酸二甲雙胍200 mL·kg-1；參考973合作團隊仝小林教授在大規(guī)模隨機雙盲臨床實驗數(shù)據(jù)[4]，葛根芩連湯組根據(jù)大鼠體質(zhì)量按11.75 mL·kg-1灌胃給藥。連續(xù)給藥3個月，正常對照組大鼠喂養(yǎng)普通飼料，其余各組繼續(xù)喂以高脂飼料。每日稱體質(zhì)量調(diào)整給藥量。實驗結(jié)束后用苯巴比妥鈉麻醉，解剖處死，取血樣和脂肪組織。用生理鹽水沖洗組織表面殘留血液并用濾紙吸干，再用錫箔紙包裹，貼好標簽放入液氮灌中，并在-80 ℃冰箱保存待測。血清樣本采用全自動生化分析儀檢測FBG，胰島素，計算胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IRI）；ELISA試劑盒檢測GSP。

2.2 糖尿病SD大鼠脂肪組織qPCR檢測mRNA表達水平 采用Qiagen公司的RNeasy liquid tissue Mini Kit 分離提取脂肪組織總RNA，Nanodrop 2000核酸蛋白測定儀檢測A260/A280和A260/A230，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性。采用符合質(zhì)控標準脂肪組織總RNA樣本4～5 μg于20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，Oligo（dT）和隨機引物進行雙引物提高逆轉(zhuǎn)錄效率，GoScriptTM Reverse Transcription System合成cDNA。通過ABI公司提供軟件Primer Premier 5.0進行β-actin，PPARγ，ADPN，GLUT4，GLUT2，乙酰輔酶A羧化酶α基因（ACACA）和乙酰輔酶A羧化酶β（ACACB）基因qPCR引物設(shè)計，引物分別針對不同的外顯子，β-actin作為內(nèi)參基因。大鼠qPCR引物序列見表1。所有qPCR引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.3 IR-3T3-L1脂肪細胞模型建立 參照本課題組已建立的3T3-L1前脂肪細胞培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化成脂肪細胞方法，采用IBMX，DEX和胰島素進行聯(lián)合誘導(dǎo)，誘導(dǎo)分化8～12 d后，90%以上呈典型的“戒環(huán)狀”脂肪細胞運用于后續(xù)實驗[6]。1 μmol·L-1DEX誘導(dǎo)3T3-L1脂肪細胞96 h，采用葡萄糖氧化酶法檢測細胞外液葡萄糖含量，計算得出葡萄糖消耗量，確認IR-3T3-L1細胞模型建立。

2.4 分組及給藥24 h葡萄糖含量檢測及細胞活力檢測 本課題組制備葛根芩連湯水提液（1 g·mL-1），UPLC-MS檢測葛根芩連湯含藥血清中多個有效成分進行質(zhì)控，具體詳見已發(fā)表文章[7]。復(fù)制2.3項中的模型，分為正常組，IR模型組，10 μmol·L-1羅格列酮組，5%，10%，15%葛根芩連湯含藥血清組。除15%葛根芩連湯含藥血清組，其余組均補足正常大鼠血清到15%。給藥干預(yù)24 h后，每組加 上10 μL CCK-8測定液孵育45 min，酶標儀檢測450 nm吸光度來計算細胞存活率。細胞存活率=IR組A450/對照組A450×100%。葡萄糖氧化酶法檢測其上清液中葡萄糖含量[8]。

2.5 IR-3T3-L1細胞內(nèi)TG含量檢測、細胞外液NEFA和ADPN含量檢測 TG測定盒測定細胞內(nèi)TG含量，同時用BCA法蛋白定量試劑盒測定總蛋白濃度，對胞內(nèi)TG數(shù)值進行校正，所得數(shù)值為TG濃度與細胞總蛋白濃度的比值，單位用mmol·μg-1表示。細胞外液中游離脂肪酸的檢測根據(jù)NEFA測定試劑盒說明操作。ELISA試劑盒檢測細胞外液中ADPN含量。

2.6 實時熒光定量PCR技術(shù)測定脂肪IR-3T3-L1細胞PPARγ，ADPN和GLUT4 mRNA水平 采用mirVanaTMmiRNA Isolation Kit分離3T3-L1脂肪細胞總RNA，其余步驟基本同2.2項。引物序列參見本課題組已發(fā)表文獻[8]，β-actin作為內(nèi)參基因。qPCR引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

2.7 Western blot檢測IR-3T3-L1細胞PPARγ，ADPN和GLUT4蛋白表達影響 參照M-PERTMMammalian Protein Extraction Reagent使用說明，將培養(yǎng)基棄去加入蛋白裂解液覆蓋細胞表面，渦旋15 s，冰上10 min，重復(fù)4次保證膜裂解完全，4 ℃離心，14 000 r·min-1，15 min后取上清；BCA法測定蛋白濃度。取各組蛋白樣品40 μg，10%SDS-PAGE凝膠分離蛋白，濕轉(zhuǎn)法（280 mA，1 h）將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至0.2 μm PVDF膜上，根據(jù)一抗說明書推薦加入5%脫脂奶粉或5%BSA的TBST封閉1 h，加入一抗蛋白4 ℃過夜，1×TBST洗PVDF膜4次，每次5～10 min；加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗蛋白1 h，充分洗滌后，加入Bio-Rad公司的ClarityTMWestern ECL Substrate，放入化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀檢測，采用Image Lab軟件分析。endprint

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)以±s表示，SPSS 17.0軟件進行組間差異比較，用單因素方差分析（One-way AVONA）及組間數(shù)據(jù)比較（與模型組相比）采用t檢驗分析，由Graphpad prism 6.0統(tǒng)計軟件完成并做圖。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 葛根芩連湯降低糖尿病大鼠FBG和胰島素含量改善HOMA-IRI 給藥前糖尿病組大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，體質(zhì)量明顯高于普通飼料喂養(yǎng)的正常組大鼠。隨著糖尿病進程加重，糖尿病大鼠體質(zhì)量不斷減輕。給藥3個月后，與正常SD大鼠體質(zhì)量（583.00±42.54） g相比，糖尿病大鼠（374.17±67.88）g明顯消瘦，體質(zhì)量減輕，而二甲雙胍組（636.6±64.47） g和葛根芩連湯組（677±60.26） g均較為穩(wěn)定。與正常大鼠相比，模型組SD大鼠FBG顯著升高；與糖尿病組相比，葛根芩連湯組和二甲雙胍組均顯著降低FBG和胰島素含量，下調(diào)HOMA-IRI，并降低GSP含量（P<0.01），見圖1。

實驗結(jié)果顯示葛根芩連湯具有明顯穩(wěn)定降糖藥效，可以增加胰島素敏感性改善IR。

3.2 葛根芩連湯上調(diào)PPARγ，ADPN，GLUT4，GLUT2，ACACA和ACACB基因mRNA表達水平 與正常組相比，模型組大鼠PPARγ，ADPN，GLUT4，GLUT2，ACACA和ACACB基因mRNA表達水平顯著下降；與模型組相比，葛根芩連湯組大鼠明顯上調(diào)PPARγ，ADPN，GLUT4，GLUT2，ACACA和ACACB基因mRNA表達水平，見圖2。

3.3 葛根芩連湯含藥血清對IR-3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗量及細胞活力的影響 與正常組相比，IR模型組葡萄糖消耗量明顯低于其他組；與IR模型組相比，給藥干預(yù)24 h后，5%，10%，15%葛根芩連湯含藥血清均明顯上調(diào)IR脂肪細胞葡萄糖消耗量（P<0.01）。各組細胞在A450處的吸光度變化不大，無統(tǒng)計學(xué)意義，表明各劑量含藥血清對IR-3T3-L1 細胞活力無顯著影響，見表2。

3.4 葛根芩連湯含藥血清對IR-3T3-L1細胞外液NEFA和ADPN含量及細胞內(nèi)TG含量的影響 與正常組相比，IR-3T-L1細胞TG含量明顯升高（P<

3.5 葛根芩連湯含藥血清上調(diào)IR-3T3-L1 脂肪細胞ADPN，PPARγ和GLUT4 mRNA表達水平 與IR模型組相比，各劑量葛根芩連湯含藥血清及陽性藥羅格列酮均上調(diào)ADPN，PPARγ和GLUT4 mRNA表達且差異顯著（P<0.01）。各劑量葛根芩連湯組細胞ADPN與PPARγ mRNA表達變化趨勢一致，而GLUT4 mRNA表達呈現(xiàn)劑量降低趨勢，見圖3。

3.6 葛根芩連湯上調(diào)IR-3T3-L1 脂肪細胞ADPN，PPARγ和GLUT4 蛋白表達水平 與IR模型組相比，給藥組均上調(diào)ADPN和GLUT4蛋白表達且差異顯著（P<0.01）。葛根芩連湯劑量依賴性激活PPARγ蛋白表達，但10%，15%葛根芩連湯組顯著上調(diào)PPARγ表達（P<0.01），見圖4。

4 討論

歷代醫(yī)家多數(shù)認為糖尿病的中醫(yī)病機是陰虛為本，燥熱為標。整理2004—2014年中國知網(wǎng)文獻發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)頻率最高的3個臨床治療糖尿病方劑是黃連解毒湯、補陽還五湯和葛根芩連湯等，而六味地黃丸是國外研究最多的降糖中藥方劑，這些常見治療糖尿病及其并發(fā)癥方劑多為滋陰補陽或清熱燥濕方劑。西醫(yī)認為高血糖是誘發(fā)糖尿病并發(fā)癥導(dǎo)致病人死亡的最直接因素，在臨床治療中強調(diào)快速降糖；中醫(yī)認為血糖高只是消渴病的表象之一，充其量為“標”，而各個腑臟間機能紊亂失調(diào)則謂之“本”，中藥降糖方劑更注重調(diào)節(jié)人體臟腑機能，降糖作用溫和穩(wěn)定，有著一定的競爭優(yōu)勢[9]。因此從機體整體角度出發(fā)，以當前中醫(yī)實踐經(jīng)驗為基礎(chǔ)，研究方劑治療糖尿病的作用機制具有重要理論和現(xiàn)實意義。

從單純降糖角度來說，清熱燥濕方劑降糖效果 優(yōu)于滋陰補陽方劑。葛根芩連湯作為經(jīng)典的清熱燥濕方劑，在調(diào)節(jié)糖脂代謝改善IR治療糖尿病方面具有很大的應(yīng)用潛力[10-11]。臨床研究發(fā)現(xiàn)中高劑量葛根芩連湯顯著降低T2DM患者FBG、餐后2 h血糖和糖化血紅蛋白，具有一定的劑量依賴性，高劑量葛根芩連湯有效增強胰島素敏感指數(shù)；揭示葛根芩連湯能改善T2DM患者IR[3]?？紤]脂肪細胞功能紊亂（脂肪因子分泌或表達）是引起全身系統(tǒng)性IR的重要誘因[12]，深入研究葛根芩連湯增強脂肪胰島素敏感性的作用機制可為臨床用藥提供理論依據(jù)和用藥指導(dǎo)。實驗結(jié)果顯示葛根芩連湯可顯著降低糖尿病SD大鼠的FBG和胰島素含量，與李穎萌等[13]結(jié)果一致。葛根芩連湯降低HOMA-IRI，增強胰島素敏感性。本實驗發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯顯著降低GSP，基于GSP是可有效反映患者過去2～3周內(nèi)血糖控制水平的中期評價指標，提示葛根芩連湯具有相對穩(wěn)定的降糖效果。

針對體外脂肪IR細胞研究，本課題組采用復(fù)方體外研究中較為公認的血清藥理學(xué)方法進行[14]?？紤]到3T3-L1脂肪細胞廣泛用于脂肪IR機制研究中，在優(yōu)化建立IR-3T3-L1脂肪細胞模型的基礎(chǔ)上進行葛根芩連湯含藥血清干預(yù)實驗。研究發(fā)現(xiàn)含藥血清含量低于20%不影響IR-3T3-L1細胞活力，不影響藥效實驗有效性，因而采用5%，10%，15% 3個劑量葛根芩連湯含藥血清干預(yù)IR-3T3-L1脂肪細胞，結(jié)果顯示葛根芩連湯含藥血清組均能顯著提高IR-3T3-L1細胞葡萄糖消耗量和降低胞內(nèi)TG含量。眾所周知，肥胖型糖尿病患者體內(nèi)脂解增加，血清中長期的NEFA濃度升高有抑制肌肉葡萄糖氧化和轉(zhuǎn)運、抑制肝糖原合成、脂肪異位沉積，影響胰島素的分泌和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和促進β細胞的凋亡等作用。調(diào)節(jié)機體的脂解，防止NEFA的過度外溢是維持機體能量代謝平衡來防治IR的重要手段。本實驗中葛根芩連湯含藥血清可降低IR-3T3-L1細胞外泌NEFA，雖然未達到統(tǒng)計學(xué)上的顯著水平，可能是由于缺乏體內(nèi)累積效應(yīng)。本課題組以往研究顯示葛根含藥血清能增加IR-3T3-L1細胞葡萄糖消耗量和降低TG，與配伍實驗中發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯降糖方中主藥是葛根的結(jié)論是相吻合的[8]。葛根芩連湯作用于IR-3T3-L1細胞降糖作用可持續(xù)穩(wěn)定至48 h，與單方葛根相比，降糖時間持續(xù)更長，降糖效果更佳。葛根芩連湯多種成分如黃酮類（葛根素、大豆苷元、黃芩素和黃芩苷）、生物堿類（小檗堿和藥根堿）、萜類（甘草苷和甘草素）等化合物，可調(diào)節(jié)糖脂代謝改善胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。即使葛根、黃芩和甘草在煎煮中降低黃連成分的含量，并不意味著葛根芩連湯復(fù)方配伍后藥效會降低。復(fù)方藥效取決于有效成分的協(xié)同作用，推測復(fù)方葛根芩連湯多藥效成分協(xié)同調(diào)控來獲得比單藥及單成分更穩(wěn)定持久的降糖效果，顯示復(fù)方配伍的合理性[15]。endprint

從分子層面看，PPARγ作為脂肪組織中唯一高豐度表達的核受體，可調(diào)節(jié)脂肪細胞因子和炎癥因子分泌增加胰島素敏感性。ADPN是PPARγ基因直接調(diào)控的脂肪分泌因子，作為反映胰島素敏感性的重要生物標志物[6]。許多天然產(chǎn)物可以通過PPARγ激活胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路增加GLUT4轉(zhuǎn)位及上調(diào)GLUT4基因表達來改善IR[16]。本研究發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯大鼠明顯上調(diào)PPARγ基因mRNA表達水平，也顯著升高ADPN和GLUT4基因mRNA表達水平。除此之外，研究還發(fā)現(xiàn)葛根芩連湯顯著升高GLUT2，ACACA和ACACB基因mRNA表達水平。ACACA和ACACB是脂肪酸代謝限速酶乙酰輔酶A羧化酶（ACC）的2個亞型，ACACA主要在細胞質(zhì)中催化長鏈脂肪酸合成，ACACB主要在線粒體膜上催化脂肪酸氧化[17]。葛根芩連湯干預(yù)糖尿病大鼠脂肪組織中ACACA和ACACB表達升高表明脂肪組織中脂合成和分解代謝增強，與PPARγ激動劑羅格列酮明顯增強ACACA表達不同，ACACA和ACACB同時表達上調(diào)可能有利于葛根芩連湯激活PPARγ增強胰島素敏感性同時減輕脂肪合成帶來明顯肥胖的副作用。葛根芩連湯含藥血清增加ADPN外泌，有助于脂肪細胞的胰島素敏感性，提示其可在體內(nèi)分泌入血遠端調(diào)控肝細胞和骨骼肌細胞胰島素敏感性。體外研究也觀察到葛根芩連湯組中小脂肪細胞數(shù)目增多，可能由于PPARγ可促進脂肪組織分化，使大脂肪細胞數(shù)量減少，增多對胰島素更敏感的小脂肪細胞數(shù)目來改善IR。

根據(jù)體內(nèi)外研究結(jié)果，推測葛根芩連湯激活PPARγ促進脂肪分化，上調(diào)GLUT4增加葡萄糖攝取和上調(diào)ADPN增強脂肪胰島素敏感性改善胰島素降糖信號通路，增強脂肪外泌ADPN來遠端調(diào)控肝臟和骨骼肌。作者擬在此基礎(chǔ)上重點研究以PPARγ為調(diào)控中心的葛根芩連湯效用網(wǎng)絡(luò)機制，深入研究復(fù)方及主藥效成分的協(xié)同作用，為臨床治療糖尿病提供理論基礎(chǔ)和用藥依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 鄭姜欽，馬坤，呂紹光.2型糖尿病中醫(yī)辨證與胰島素抵抗的關(guān)系[J].中華中醫(yī)藥雜志，2010，25（8）：1318.

[2] 寇麗霞，樂麗珍，邱聯(lián)群.2型糖尿病中醫(yī)證型與飲食嗜好差異的規(guī)律性研究[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2010，26（17）：3247.

[3] 趙林華，連鳳梅，姬航宇，等.仝小林教授運用不同劑量葛根芩連湯治療2型糖尿病驗案[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2011，17（4）：249.

[4] Xu J， Lian F M， Zhao L H， et al. Structural modulation of gut microbiota during alleviation of type 2 diabetes with a Chinese herbal formula[J]. ISME J， 2015， 9（3）：552.

[5] Zhang C H， Xu G L， Liu Y H， et al. Anti-diabetic activities of Gegen Qinlian decoction in high-fat diet combined with streptozotocin-induced diabetic rats and in 3T3-L1 cells[J]. Phytomedicine，2013，20：221.

[6] 涂珺，羅新新，李冰濤，等.小檗堿對脂肪胰島素抵抗細胞PPARγ及脂肪分泌因子表達的影響[J].中國中藥雜志，2016，41（11）：1983.

[7] 彭國梅，張啟云，李冰濤，等. UPLC-MS/MS同時測定葛根芩連湯含藥血清10個有效成分的含量[J].中藥新藥與臨床藥理，2016，27（3）：393.

[8] 羅新新，徐國良，黎宇，等. 葛根調(diào)節(jié)脂肪細胞糖脂代謝改善胰島素抵抗的研究[J].中國中藥雜志，2016，41（14）：2687.

[9] 丁學(xué)屏. 淺談糖尿病診治的方法與思考[C].北京：糖尿病中醫(yī)研究進展——全國第六次中醫(yī)糖尿病學(xué)術(shù)會議，2000：30.

[10] 尚文斌，錢莜雨，劉佳.清熱解毒法治療在糖尿病慢性炎癥狀態(tài)的研究進展[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2012，18（10）：1172.

[11] 仝小林.黃連為主藥系列經(jīng)方在糖尿病辨治中的運用[J].中醫(yī)雜志，2013，54（3）：209.

[12] Olivecrona G. Role of lipoprotein lipase in lipid metabolism[J]. Curr Opin Lipidol， 2016， 27（3）：233.

[13] 李穎萌，范雪梅，王義明，等. 葛根芩連湯對2型糖尿病大鼠的治療作用及其機制探討[J].藥學(xué)學(xué)報，2013，48（9）：1415.

[14] 馬飛祥，薛培鳳，王媛媛，等. 中藥血清藥物化學(xué)研究進展[J].中國中藥雜志，2017，42（7）：1265.

[15] 楊飛，吳德康，陳麗紅，等. 葛根芩連湯中葛根素、黃芩苷、小檗堿與甘草酸組合在大鼠體內(nèi)代謝產(chǎn)物研究[J].中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19（9）：164.

[16] Wang L， Waltenberger B， Pferschy-Wenzig E M， et al. Natural product agonists of peroxisome proliferator-activated receptor gamma （PPARγ）： a review[J]. Biochem Pharmacol， 2014， 92（1）： 73.

[17] 林志健，張冰，劉小青. AMPK-ACC信號通路與相關(guān)代謝疾病的研究進展[J]. 中國糖尿病雜志，2013，21（5）：474.

[責(zé)任編輯 張寧寧]endprint