劉月紅+黃政海+董玲+裴紋萱+孫裕+高曉燕

[摘要] 建立高效液相色譜法同時測定大黃中大黃素、大黃酚、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、番瀉苷A、番瀉苷B、沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-4′-羥基苯基-2-丁酮、蓮花掌苷、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷14個成分含量的方法。采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm），采用0.05%的磷酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相，梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，檢測波長268 nm。結(jié)果表明在線性范圍內(nèi)14個成分線性良好（r>0.999 9）；日內(nèi)精密度和日間精密度均小于3.1%；平均回收率在91.80%～104.1%。同時，對收集到的10個掌葉大黃和10個唐古特大黃合格樣品進行定量測定，發(fā)現(xiàn)掌葉大黃中含量比較高的成分是蘆薈大黃素，唐古特大黃中含量比較高的是4-4′-羥基苯基-2-丁酮，各樣品中所有化合物的含量差異都比較大。所建立的含量測定方法能同時測定大黃中14個成分的含量，為大黃藥材多成分含量測定和質(zhì)量控制提供一種簡便的方法。

[關鍵詞] 大黃； 高效液相色譜法； 蒽醌類； 苯丁酮苷類； 鞣質(zhì)類； 含量測定

[Abstract] To establish an HPLC （high performance liquid chromatography） method for the simultaneous content determination of gallic acid， （+）-catechin， （-）-epicatechin-3-O-gallate， isolindleyin， 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone， emodin， chrysophanol， physcion， aloe-emodin， rhein， lindleyin， 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone-4′-O-β-D-（2″-O-galloyl-6″-O-cinnamoyl）-glucopyranoside， sennoside A and sennoside B in Rhei Radix et Rhizoma. The analysis was performed on Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm×150 mm， 5 μm） with 0.05% phosphoric acid solution （A） - acetonitrile （B） as mobile phase for gradient elution. The flow rate was 1 mL·min-1， with column temperature of 40 ℃ and the wavelength was set at 268 nm. All calibration curves showed good linearity （r > 0.999 9） within the concentration range. Both the intra- and inter-day precision for 14 analytes was less than 3.1%， with the mean recovery at the range of 91.80%-104.1%. Meanwhile， quantitative determination was carried out for 10 qualified samples from Rheum palmatum and 10 qualified samples from R. tanguticum. respectively. It was found that the content of 4-（4′-hydroxyphenyl）-2-butanone and aloe-emodin were higher in the R. tanguticum and R. palmatum， respectively， and the content of all the compounds was different in each sample. The established HPLC method for simultaneous content determination of 14 compounds from Rhei Radix et Rhizoma could be used for quantitative assessment and quality control of Rhei Radix et Rhizoma.

[Key words] Rhei Radix et Rhizoma； HPLC； anthraquinones； butanone glycosides； tannins； content determination

大黃為蓼科植物掌葉大黃 Rheum palmatum L.、唐古特大黃 R. tanguticum Maxim. ex Balf. 或藥用大黃R. officinale Baill.的干燥根和根莖[1]。目前，對于大黃的化學成分和藥理作用都比較清楚。從大黃屬植物中已分離得到160多種化合物[2]，按照化學結(jié)構(gòu)可分為蒽醌衍生物、二苯乙烯苷、苯丁酮苷、鞣質(zhì)、有機酸等。藥理研究表明大黃具有瀉火[3]、利膽[4]、保肝[5]、抗菌[5]、抗炎[6]及抗癌[7]等藥理作用，據(jù)報道蒽醌及其苷類是瀉下作用的主要活性成分，其中番瀉苷活性最強[8]。2015年版《中國藥典》規(guī)定大黃含大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚5種蒽醌的總量不得少于1.5%[1]，而其瀉下的主要活性成分番瀉苷的量未做要求，此外，雖然大黃中多成分的含量測定方法已有報道，主要方法有薄層色譜法[9]、高效液相色譜-紫外檢測法[10]、高效液相色譜-質(zhì)譜法[11]、高效毛細管電泳法[12]、毛細管電泳色譜法[13-18]，但是關于苯丁酮苷類化合物的含量測定未見報道。因此，本實驗建立了一種同時測定大黃中蒽醌類、苯丁酮苷類以及鞣質(zhì)類共14個化合物的含量測定方法，為大黃質(zhì)量控制水平的提高提供方法學依據(jù)。endprint

1 材料

電子分析天平 （BP211D，ALC-210.4，CPA225D） 為德國Sartorius公司產(chǎn)品；超聲波清洗器 （D-78224） 為德國ELMA公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，SB-1000數(shù)字水浴鍋及CA-1111循環(huán)冷凝水系統(tǒng)） 為日本EYELA公司產(chǎn)品；Agilent 1100液相色譜儀 （Four-unit pump，Auto-sampler，DAD detector，Chemstation workstation） 為美國Agilent公司產(chǎn)品。

分析純甲醇和磷酸為北京化工廠產(chǎn)品，色譜純甲醇和乙腈為默克公司產(chǎn)品 （Merk，Darmstadt，Germany），去離子水經(jīng)Milli-Q系統(tǒng)純化。

沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-4′-羥基苯基-2-丁酮、蓮花掌苷、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子酰基）-葡萄糖苷、大黃素和大黃酚9種對照品為本實驗室分離得到（經(jīng)HPLC歸一化法檢測，純度大于98%），大黃酸（批號0757-200206）、蘆薈大黃素（批號110795-200605）和大黃素甲醚（批號110758-200610）3種對照品購自中國食品藥品檢定研究院，番瀉苷A（批號1126070-15204229）、番瀉苷B（批號1165756-20905097）購自美國Fluka公司。

掌葉大黃和唐古特大黃藥材均經(jīng)北京大學中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心屠鵬飛教授分別鑒定為蓼科植物掌葉大黃R. palmatum和唐古特大黃R. tanguticum的干燥根及根莖。本實驗采用2015年版藥典大黃含量測定方法，對所采集到的36批掌葉大黃樣品、39批唐古特大黃樣品進行了含量測定，從2種大黃中分別篩選出10批合格樣品，見表1，進行以上14個指標成分的定量，以期確定合格大黃中這些指標成分的含量范圍。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent Zorbax SB-C18 （4.6 mm × 150 mm，5 μm），預柱為Agilent Zorbax Extend C18 （4.6 mm×10 mm，5 μm）。進樣量10 μL，檢測波長268 nm，流速1.0 mL·min-1，柱溫40 ℃，流動相0.05%的磷酸水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，2%～10% B； 5～13 min，10%～15% B； 13～26 min，15%～17% B； 26～38 min，17%～22% B； 38～54 min，22%～36%B； 54～60 min，36%～60% B； 60～80 min，60% B）。

2.2 對照品溶液的配制 分別稱取沒食子酸0.34 mg、兒茶素0.65 mg、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯11.8 mg、異蓮花掌苷8.4 mg、4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮6.10 mg、蓮花掌苷2.95 mg、番瀉苷B 2.54 mg、番瀉苷A 1.86 mg、蘆薈大黃素1.05 mg、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷0.77 mg、大黃酸0.79 mg、大黃素0.77 mg、大黃酚0.88 mg、大黃素甲醚0.76 mg，分別置于5 mL量瓶中，用70%甲醇定容至刻度，儲存于4 ℃的冰箱中，作為對照品貯備液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 將干燥的大黃藥材粉碎，過100目篩，精密稱取本品粉末1 g，置于具塞三角瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取1 h，放冷，用70%甲醇補足失重，搖勻，過濾（0.22 μm），取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 色譜條件的優(yōu)化 為保證被定量化合物良好的分離度和適當?shù)谋Ａ魰r間，本實驗對磷酸的濃度、色譜柱的型號和流動相的梯度程序進行了考察，分別選用0.01%，0.02%，0.03%，0.05%，1.0%的磷酸溶液為流動相，比較不同濃度的磷酸對被分離化合物的分離度和峰形的影響，發(fā)現(xiàn)0.05%磷酸時，7個待測成分的峰形和分離度較好，因此本研究確定 0.05%磷酸；大黃藥材中化學成分復雜，色譜圖中有蒽醌類、苯丁酮苷類、二苯乙烯苷類、鞣質(zhì)類等成分，為保證待測成分在具有良好分離度條件下出柱時間較短（本實驗控制在70 min內(nèi)），本研究考察了3種不同型號的150 mm色譜柱，Agilent ZORBAX SB-C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm）、Kromasil C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm） 和DiamonsilTM C18 （4.6 mm×150 mm，5 μm），研究發(fā)現(xiàn)應用Agilent ZORBAX SB-C18時待測成分的分離度最好，因此本研究選擇的色譜柱為Agilent ZORBAX SB-C18；為使番瀉苷A與番瀉苷B與相鄰的色譜峰分開，本實驗嘗試了多個流動相梯度，最后確定為上述的梯度程序。應用以上所建立的色譜條件進行分析，所得到的對照品和樣品的色譜圖，見圖1，14個被測化合物都實現(xiàn)了良好的分離。色譜圖中的14個待測化合物的鑒別是通過對比保留時間、在線UV光譜以及加入對照品的方法完成的。

2.5 工作曲線的建立 大黃生長在海拔2 200～4 400 m的高原地帶，生長環(huán)境多樣，野生大黃的生長年份無從考證，其中各種化合物的化學成分差別很大，因此本實驗所建立的各待測成分的工作曲線的線形范圍都很寬。具體方法為將各對照品貯備液 分別稀釋至6個不同濃度，得系列對照品溶液，每個濃度進樣2次，取其峰面積平均值為縱坐標，濃度為橫坐標，進行回歸分析，所得各回歸方程見表2。

2.6 檢測限和定量限 檢測限是指從背景干擾中區(qū)分出被測定物的最低濃度，即信噪比為3時的樣品濃度，定量限是信噪比為10時的樣品濃度，各個被測物的檢測限與定量限見表2。endprint

2.7 精密度試驗 精密度的評價是通過測定各對照品的日內(nèi)、日間精密度來實現(xiàn)的，各對照品分別選取高、中、低3個不同濃度，日內(nèi)精密度的做法是在同一天內(nèi)每個濃度重復測定6次，而日間精密度則是在連續(xù)的3 d每天每個濃度重復測定2次來完成的，通過計算相對標準偏差（RSD）來評價方法的重現(xiàn)性。結(jié)果表明，沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮、蓮花掌苷、番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的日內(nèi)精密度和日間精密度分別小于2.3%和3.1%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗 精密稱取唐古特大黃11號藥材細粉6份，每份1 g，按照前面所描述的樣品溶液制備及分析方法進行測定，結(jié)果得沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮、蓮花掌苷、番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮酰基-6″-O-沒食子酰基）-葡萄糖苷、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚14個成分的平均質(zhì)量分數(shù)分別為0.04，0.02，0.32，0.56，8.09，4.05，1.58，0.82，2.11，1.23，0.33，0.08，0.21，0.06 mg·g-1。RSD分別為1.3%，1.2%，2.0%，2.4%，2.4%，2.4%，1.3%，1.9%，1.2%，2.4%，2.2%，3.6%，2.9%，3.2%，結(jié)果表明試驗重復性良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗 精密稱取掌葉大黃藥材細粉1 g，按照前面所描述的方法制成供試品溶液，分別間隔2，4，6，9，12 h進行測定，結(jié)果得沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮、蓮花掌苷、番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子酰基）-葡萄糖苷、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的RSD分別小于1.7%，2.0%，1.5%，2.2%，3.0%，2.2%，1.8%，2.2%，2.9%，1.8%，2.0%，3.0%，3.3%，3.1%，表明樣品在室溫下放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.10 回收率試驗 精密稱取掌葉大黃藥材細粉9份，每份0.5 g，分別加入高、中、低3個濃度的對照品混合液，每個濃度3份，按照前面所描述的樣品溶液制備及分析方法進行測定，計算回收率和RSD，得沒食子酸、兒茶素、（-）-表兒茶素-3-沒食子酸酯、異蓮花掌苷、4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮、蓮花掌苷、番瀉苷B、番瀉苷A、蘆薈大黃素、4′-羥基苯基-2-丁酮-4′-O-β-D-（2″-O-桂皮?；?6″-O-沒食子?；?葡萄糖苷、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均回收率在91.80%～104.1%，RSD分別是2.1%～3.6%，3.6%～4.1%，2.4%～3.4%，3.1%～4.2%，2.8%～2.9%，3.1%～4.0%，3.7%～ 4.4%，3.9%～4.3%，1.9%～2.8%，1.5%～2.1%，2.8%～3.9%，2.2%～3.0%，1.2%～2.6%，1.7%～2.9%。

2.11 樣品的含量測定 應用所建立的方法，測定了以上10個掌葉大黃合格樣品10個唐古特大黃合格樣品，見表3，從表中數(shù)據(jù)可以看出，掌葉大黃中含量比較高的成分是蘆薈大黃素；唐古特大黃中含量比較高的是4-（4′-羥基苯基）-2-丁酮，各樣品中所有化合物的含量差異都比較大，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的比例關系。

3 討論

本實驗所用的36批掌葉大黃樣品和39批唐古特大黃樣品都是采自不同的海拔高度、不同的生長條件，為了考察所測定的14個指標成分在大黃中的分布特點，首先按照2015年版《中國藥典》大黃項下質(zhì)量標準對采集的樣品中的指標成分進行了含量測定，選擇了10批合格的藥材，對這10批合格的藥材進行了14個指標成分進行了含量測定，以評價大黃當中不同類別指標成分分布的特點，這些類別包括蒽醌類、蒽醌苷類、雙蒽酮類、苯丁酮苷、鞣質(zhì)、苯丁酮苷類，旨在對提升大黃的質(zhì)量評價方法提供參考數(shù)據(jù)。

2015年版藥典規(guī)定大黃有3種基原，包括掌葉大黃R. palmatum、唐古特大黃R. tanguticum和藥用大黃R. officinale，但在實際的采樣過程中發(fā)現(xiàn)，野生的藥用大黃很少，采集的樣品有限，因此本文只檢測了2種主要存在的大黃，即掌葉大黃和唐古特大黃，而沒有對藥用大黃進行考察。

由于大黃中所含化學成分復雜，主要包括蒽醌類、苯丁酮苷類以及鞣質(zhì)類，為了能較全面評價該藥材質(zhì)量，本實驗除了對色譜條件進行優(yōu)化，還重點對大黃的提取條件進行優(yōu)化，包括提取溶劑、提取方式和提取時間。在提取溶劑方面，考察了30%，50%，60%，70%，100%甲醇溶液以及30%，50%，60%，70%，100%乙醇溶液，為了盡量全面的反應大黃化學信息的全面性，通過比較各種不同提取溶劑提取后所得到的色譜峰的峰面積，最終選擇了70%甲醇溶液作為大黃的提取溶劑；提取方式采用了超聲、加熱回流和靜置過夜這3種常用提取方法，通過比較色譜圖中色譜峰的數(shù)量和峰面積，選擇了超聲提取法；在超聲提取時間方面，結(jié)果表明超聲1.0 h的提取效果和超聲1.5 h 以及超聲2.0 h的效果相似，因此選擇超聲提取時間為1.0 h。最終確定的提取方法為70%甲醇超聲提取1.0 h。

本實驗建立的高效液相色譜法實現(xiàn)了對大黃中14個指標成分的含量測定，確定了質(zhì)量合格的唐古特大黃樣品、掌葉大黃樣品中14個化學成分的含量范圍，為大黃質(zhì)量控制水平的提高提供了可供借鑒的方法。雖然所定量這些成分的藥理作用并不完全清楚，但是在目前大黃藥效物質(zhì)基礎不明確的情況下，這種多指標含量測定相對于少數(shù)成分定量有利于控制大黃質(zhì)量。實驗中還發(fā)現(xiàn)，大黃中可能還含有其他含量比較高的成分，但是由于缺乏相應的對照品而無法進行含量測定，因此，化學對照品的缺乏是制約中藥質(zhì)量控制水平提高的關鍵問題之一。endprint

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[責任編輯 孔晶晶]endprint