黃 俊，楊 婉，金世云，產(chǎn)進中，劉 中，張 野，何淑芳

(安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院麻醉科，安徽 合肥 230601)

全心缺血/再灌注損傷常見于體外循環(huán)下的心臟及大血管手術、心跳驟停后心肺復蘇等，缺血的心肌在循環(huán)開放或冠脈血流恢復后，可能發(fā)生更為嚴重的心肌損傷[1-2],認識和防治心肌缺血/再灌注損傷已成為心臟病學和麻醉學領域的重要課題。本課題組前期研究結果顯示，嗎啡預處理對大鼠局部心肌缺血/再灌注損傷以及H9c2心肌細胞缺氧/復氧損傷具有減輕作用[3-4]，而嗎啡預處理(morphine preconditioning, MPC)對大鼠全心缺血/再灌注損傷的作用及其機制鮮有報道。細胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signaling-regulated kinase, ERK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)家族成員，ERK信號通路活化有利于減輕心肌缺血/再灌注損傷[5]。本研究中，我們采用Langendorff離體灌注模型，觀察MPC對大鼠全心缺血/再灌注損傷的影響，并探討ERK信號蛋白所發(fā)揮的作用。

1 材料與方法

1.1藥品、試劑與儀器鹽酸嗎啡注射液(批號：130113.2，東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride, TTC)(批號：129K1867V, 美國Sigma公司)；乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；ERK抑制劑PD98059(Cell Signaling公司)；鼠抗β-actin單克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；兔抗p-ERK1/2(Thr202/204)、ERK1/2單克隆抗體(Cell Signaling公司)；ECL發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)。PowerLab數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(澳大利亞AD公司)；Langendorff灌注系統(tǒng)(安徽淮北正華有限責任公司)；Tanon全自動凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有公司)。

1.2動物模型制備與分組處理健康♂成年SD大鼠，體質量200～250 g，由安徽醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物合格證號：SCXK(皖)2005-001。采用隨機數(shù)字表法分為6組(n=10)：對照組(CON組)、缺血/再灌注組(I/R組)、缺血預處理組(ischemia preconditioning, IPC組)、 嗎啡1 μmol·L-1預處理組(MPC組)、 嗎啡預處理+PD98059 (10 μmol·L-1) 組(MPD組)、PD98059 (10 μmol·L-1) 組(PD組)。參照文獻[6]介紹的方法制備全心缺血/再灌注損傷模型，大鼠迅速斷頭處死，取出心臟，置于4℃ K-H液中，立即懸掛于Langendorff灌注裝置上，經(jīng)主動脈逆行灌注K-H液(NaCl 118.5、KCl 4.7、MgSO41.2、KH2PO41.2、CaCl22.5、NaHCO325.0、葡萄糖11.0，單位： μmol·L-1)。K-H液用95% O2∶5% CO2混合氣進行預充平衡，維持K-H液pH值7.35～7.45，灌注壓9.8 kPa，溫度37℃。將一注水橡膠球囊經(jīng)左心耳置入至左心室，連接PowerLab壓力傳感器，測量左心室壓力。操作完成，待心臟穩(wěn)定后，有明顯心律失?；蜃笫野l(fā)展壓(left ventricular developed pressure, LVDP)<12 kPa的心臟棄之不用。通過夾閉灌流導管停灌40 min，恢復K-H液灌注90 min制備大鼠離體心臟缺血/再灌注損傷模型。CON組持續(xù)灌注K-H液175 min。I/R組于缺血/再灌注之前灌注K-H液45 min。IPC組先灌注15 min,再進行缺血預處理，即缺血5 min，恢復灌注K-H液5 min，共3個循環(huán)，然后制備心臟缺血/再灌注損傷模型。MPC組先灌注K-H液15 min，再灌注含1 μmol·L-1嗎啡的K-H液5 min，再灌注不含嗎啡的K-H液5 min，共3個循環(huán)；MPD組于MPC前10 min持續(xù)灌注含有PD98059(10 μmol·L-1)的K-H液，直至再灌注5 min；PD組在相同時間點灌注含PD98059(10 μmol·L-1)的K-H液，但不進行預處理，然后分別制備心臟缺血/再灌注損傷模型。

1.3LDH活性檢測所有組分別于心臟穩(wěn)定灌注15 min(基線)、再灌注5、10 min時，收集冠脈流出液，采用化學比色法檢測LDH活性。

1.4Westernblot測定p-ERK相對表達于再灌注10 min時取下大鼠心臟(每組4只)，加入RIPA裂解液，冰上靜置30 min后，15 000 r·min-1、4℃離心10 min后吸取上清，BCA法測定蛋白濃度。蛋白質樣本按1 ∶4加入5×上樣緩沖液，95℃變性5 min，使用蛋白預制膠進行SDS-PAGE電泳。140 V電泳60 min，然后電轉移至PVDF膜，將PVDF 膜在封閉液(含5%脫脂牛奶的TBST 溶液)中室溫孵育2 h，TBST液漂洗10 min×3次，分別加入p-ERK、ERK單克隆兔抗(1 ∶800稀釋)或β-actin(1 ∶500稀釋)單克隆鼠抗，4℃孵育過夜。次日TBST液漂洗10 min×3次，在山羊抗兔IgG(1 ∶10 000稀釋)或山羊抗小鼠IgG(1 ∶20 000稀釋)中室溫孵育1 h，TBST液漂洗5 min×3次，采用ECL發(fā)光試劑盒，在Tanon全自動凝膠成像系統(tǒng)中自動曝光采集圖像。采用Image J 1.38e圖像分析軟件進行條帶光密度分析，以p-ERK蛋白與ERK及β-actin蛋白灰度值的比值表示p-ERK的相對表達量。

1.5心臟梗死體積測定每組另外6只心臟于再灌注90 min時，取下大鼠心臟；置于-80℃冰箱中，待充分冷凍后，行冰凍切片，沿心臟縱軸線切5～6片，每片厚約2 mm。切片放于1% TTC溶液中，37℃水浴鍋中孵育15 min；隨后用10%中性福爾馬林液固定過夜，缺血危險區(qū)中呈白色為梗死區(qū)，呈紅色為非梗死區(qū)。采用Image J 1.38e圖像分析軟件，計算缺血危險區(qū)(area at risk, AAR)、 梗死區(qū)(infarct size, IS) 及IS/AAR比值。

1.6心功能指標檢測通過Power Lab系統(tǒng)分別記錄各組平衡15 min(baseline)、預處理結束后(treatment)，再灌注90 min(Reperfusion-90, Re-90)時的心率(heart rate, HR)、LVDP以及冠脈流出液(coronary out-flow, CF)。

2 結果

2.1心肌梗死體積Fig 1的TTC結果顯示，與對照組比較，I/R組IS/AAR明顯增加；而IPC和MPC組明顯減少了IS/AAR，這提示MPC可以發(fā)揮心肌保護作用。與MPC比較，MPD組IS/AAR增加，提示ERK抑制劑能夠完全或部分阻斷嗎啡的心肌保護作用。PD組IS/AAR與對照組差異有統(tǒng)計學意義，與I/R組差異無統(tǒng)計學意義。各組之間AAR差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2冠脈流出液LDH活性如Fig 2所示，與對照組LDH活性比較，再灌注5、10 min時，I/R組LDH活性明顯升高，而IPC和MPC明顯降低了LDH的活性，ERK抑制劑阻斷了MPC降低LDH的作用。PD組各時間點LDH活性與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義，與I/R組比較差異無統(tǒng)計學意義。各組LDH基礎值(baseline)差異無統(tǒng)計學意義。

2.3心功能測量與對照組比較，再灌注90 min(Re-90)末時的LVDP、HR、CF差異有統(tǒng)計學意義；與I/R組比較，MPC能夠促進再灌注90 min(Re-90 min)末時的心功能恢復(Tab 1)。

2.4MPC對ERK蛋白磷酸化的影響Fig 3 Western blot結果顯示，與對照組比較，I/R組p-ERK輕微增加，但無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而IPC和MPC組明顯增加了p-ERK的表達(P<0.01)。

Fig 1 Infarct size expressed by IS/AAR using TTC staining (±s, n=6)

A: Representative images of TTC staining showing infarct size (white) and area at risk (red); B: Myocardial injury expressed as a percentage of infarct size (IS) with respect to the area at risk (AAR).**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsI/R group;##P<0.01vsMPC group; C: The value of AAR.

Tab 1 The hemodynamic parameters (±s, n=6)

**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsI/R group

Fig 2 LDH activity of coronary effluent (±s, n=6)

The LDH activity was detected at baseline, 5 and 10 min of reperfusion, respectively.**P<0.01vscontrol group;△△P<0.01vsI/R group;##P<0.01vsMPC group.

與MPC組比較，ERK抑制劑明顯降低了MPC上調p-ERK的作用(P<0.01)。

**P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsMPC group

3 討論

圍手術期心肌損傷是心臟手術后的重要并發(fā)癥，嚴重影響患者的預后和轉歸。其中，由于體外循環(huán)、心臟長時間停跳所致的全心缺血/再灌注損傷，是引起圍手術期心肌損傷和功能障礙的重要原因之一[7]。本研究采用大鼠離體心臟全心停灌-再灌注模型，模擬臨床體外循環(huán)下心臟或冠脈手術過程中的心臟停跳-復跳過程，證明嗎啡預處理對大鼠全心缺血/再灌注損傷具有明顯減輕作用，并發(fā)現(xiàn)ERK信號通路蛋白活化在嗎啡預處理介導的心肌保護中發(fā)揮重要作用。

本研究參照文獻[6]的方法，采用Langendorff離體灌注系統(tǒng)制備全心缺血40 min，再灌注90 min的損傷模型。結果表明，全心缺血/再灌注可造成廣泛性心肌梗死，再灌注5、10 min時冠脈流出液LDH活性明顯升高，而且再灌注結束時LVDP明顯降低，提示大鼠離體全心缺血/再灌注損傷模型制備成功。全心缺血/再灌注損傷不同于冠脈結扎引起的局部心肌損傷，心肌梗死的面積更為廣泛，對心臟功能的影響更為明顯。因此，利用大鼠全心缺血/再灌注損傷模型，有利于更好地模擬臨床實際情況，為心臟或冠脈手術患者的圍手術期心肌保護策略研究提供基礎。

嗎啡是臨床麻醉中常用的阿片類鎮(zhèn)痛藥物，廣泛應用于心血管手術麻醉和術后鎮(zhèn)痛，與經(jīng)典的IPC相比，在心臟或冠脈手術前應用嗎啡預處理，具有給藥方便、無損傷性、符合倫理等優(yōu)點。大量研究表明，嗎啡預處理可模擬IPC，明顯減輕大鼠冠狀動脈結扎誘導的局部心肌缺血/再灌注損傷[8-9]，但關于其對抗全心缺血/再灌注損傷的研究相對較少。本研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡預處理可明顯降低心肌梗死面積以及再灌注5、10 min的LDH活性，且再灌注結束時LVDP明顯改善，與經(jīng)典IPC介導的心肌保護效應相當，說明嗎啡預處理可對抗全心缺血/再灌注損傷，并有效促進心臟功能恢復。與本研究一致的是，臨床試驗研究表明，嗎啡術前給藥可預防體外循環(huán)下心臟手術或冠脈手術后心肌缺血損傷、促進心肌功能恢復[10]，然而其作用機制尚不明確。

阿片類藥物預處理主要通過激活心臟上的阿片受體，其中以激動δ和κ阿片受體為主，繼而活化下游的多種蛋白激酶，如蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)、蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)、ERK等。這些信號通路的活化，最終導致線粒體滲透性轉化孔(mitochondrial permeability transition pore, mPTP)關閉，從而減少線粒體內凋亡因子的釋放，抑制心肌細胞凋亡；或通過開放線粒體ATP敏感鉀通道，使得鈣通道關閉，抑制鈣離子超載對心肌細胞的損傷[11]。ERK蛋白是一種重要的促生存激酶，再灌注期間ERK通路激活可通過抑制糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)活性，繼而作用于mPTP，維持線粒體的完整性及功能[11-12]。已有研究報道，阿片類藥物減輕局部心肌缺血/再灌注損傷與ERK信號通路活化密切相關[13-14]，但嗎啡預處理對抗全心缺血/再灌注損傷是否也通過激活ERK信號通路，仍不清楚。本實驗中，嗎啡預處理和IPC均能明顯增強ERK磷酸化水平，提示嗎啡預處理介導的心肌保護作用與ERK激酶活化有關。ERK信號通路抑制劑PD98059可明顯阻斷嗎啡的心肌保護作用，增加心肌梗死面積和LDH活性，并影響心臟功能恢復，進一步提示嗎啡預處理減輕全心缺血/再灌注損傷，可能依賴于ERK信號蛋白的活化，然而其下游信號分子機制仍待進一步探討。

綜上所述，本研究證明嗎啡預處理能夠減輕大鼠離體全心缺血/再灌注損傷，促進再灌注期間心臟功能的恢復，其心肌保護作用可能依賴于ERK信號蛋白的磷酸化，為臨床心臟手術患者圍手術期心肌損傷的防治提供了理論基礎和依據(jù)。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院中心實驗室為本課題研究提供儀器設備和技術支持。)

[1] Zhao Z G, Tang Z Z, Zhang W K, et al. Protective effects of embelin on myocardial ischemia-reperfusion injury following cardiac arrest in a rabbit model[J].Inflammation, 2015,38(2): 527-33.

[2] Wang G X, Zhang Q, Yuan W, et al. Enalapril protects against myocardial ischemia/reperfusion injury in a swine model of cardiac arrest and resuscitation[J].IntJMolMed, 2016,38(5): 1463-73.

[3] 韓正怡, 何淑芳, 程 潔, 等. 嗎啡預處理對 H9c2 心肌細胞缺氧/復氧時 microRNA 表達的影響[J]. 中國藥理學通報, 2015,31(11): 1552-7.

[3] Han Z Y, He S F, Cheng J, et al. Effects of morphine preconditioning on expression of microRNAs during hypoxia-reoxygenation in H9c2 myocardial cells[J].ChinPharmacolBull, 2015,31(11): 1552-7.

[4] 張 引，金世云，何淑芳，等. JNK信號通路和p38MAPK信號通路在嗎啡預處理減輕心力衰竭大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用[J].中華麻醉學雜志，2016，36(2)：219-22.

[4] Zhang Y, Jin S Y, He S F, et al. Role of JNK and p38MAPK signaling pathways in reduction of ischemia-reperfusion injury by morphine preconditioning in rats with heart failure[J].ChinJAnesthesiol, 2016,36(2): 219-22.

[5] Liu Z, Chen J M, Huang H, et al. The protective effect of trimetazidine on myocardial ischemia/reperfusion injury through activating AMPK and ERK signaling pathway[J].Metabolism, 2016,65(3): 122-30.

[6] Feng J H, Fischer G, Lucchinetti E, et al. Infarct-remodeled myocardium is receptive to protection by isoflurane postconditioning——role of protein kinase B/Akt signaling[J].Anesthesiology, 2006,104(5):1004-14.

[7] Woods C E, Shang C, Taghavi F, et al.Invivopost-cardiac arrest myocardial dysfunction is supported by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ-mediated calcium long-term potentiation and mitigated by Alda-1, an agonist of aldehyde dehydrogenase type 2[J].Circulation, 2016,134(13): 961-77.

[8] 胡 軍, 張 野, 陸 姚, 等. NO/cGMP 信號通路在鞘內嗎啡預處理減輕大鼠心肌缺血/再灌注損傷中的作用[J]. 中國藥理學通報, 2014,30(6): 829-33.

[8] Hu J, Zhang Y, Lu Y, et al. Role of NO/cGMP in the cardioprotective effects of intrathecal morphine preconditioning against myocardial ischemia-reperfusion injury in rats[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(6): 829-33.

[9] Zhang X, Li J, Yang J, et al. Fentanyl combined with butorphanol protects myocardial ischemia/reperfusion injury via κ-opioid receptor-mediated Nrf2-ARE signaling[J].IntJClinExpMed, 2016,9(2): 2500-6.

[10] Murphy G S, Szokol J W, Marymont J H, et al. Opioids and cardioprotection: the impact of morphine and fentanyl on recovery of ventricular function after cardiopulmonary bypass[J].JCardiothoracVascAnesth, 2006,20(4): 493-502.

[11] Headrick J P, See Hoe L E, Du Toit E F,Peart J N. Opioid receptors and cardioprotection- ‘opioidergic conditioning’ of the heart[J].BrJPharmacol, 2015,172(8): 2026-50.

[12] Wu N, Zhang X W, Guan Y, et al. Hypercholesterolemia abrogates the cardioprotection of ischemic postconditioning in isolated rat heart: roles of glycogen synthase kinase-3 beta and the mitochondrial permeability transition pore[J].CellBiochemBiophys, 2014,69(1): 123-30.

[13] He S F, Jin S Y, Wu H, et al. Morphine preconditioning confers cardioprotection in doxorubicin-induced failing rat hearts via ERK/GSK-3beta pathway independent of PI3K/Akt[J].ToxicolApplPharmacol, 2015,288(3): 349-58.

[14] Peart J N, Gross E R, Gross G J. Opioid-induced preconditioning: recent advances and future perspectives[J].VasculPharmacol, 2005,42(5-6): 211-8.