潘增烽，周 園，阮 巖，羅 霞，閆亞杰，周 聯(lián)

(1. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東 廣州 510405；3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405)

過敏性哮喘是由嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種細(xì)胞參與的慢性氣道炎癥疾病，常表現(xiàn)為以支氣管平滑肌收縮為主的過敏反應(yīng)性癥狀及Th2型炎癥反應(yīng)[1]?，F(xiàn)認(rèn)為胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)是Th2型炎癥反應(yīng)的重要啟動(dòng)因素[2]。過敏原或炎癥因子刺激上皮細(xì)胞產(chǎn)生TSLP[3]。TSLP因子可以通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟、誘導(dǎo)Th2型細(xì)胞增加及相應(yīng)的炎癥因子釋放，最終導(dǎo)致嗜酸粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，加重哮喘的炎癥反應(yīng)[4]。

兒茶素是茶多酚中的主要活性成分，已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)其可緩解過敏性角膜炎豚鼠的過敏癥狀[5]，且有一定的體外抗炎作用[6]，但其對(duì)過敏性哮喘是否有治療作用尚不明確。故本研究對(duì)兒茶素對(duì)卵清蛋白(ovalbumin, OVA)所致過敏性哮喘小鼠的治療作用及其機(jī)制進(jìn)行了初步探討。

1 材料

1.1試劑兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、OVA(美國(guó)Sigma公司)；氯雷他定片(批號(hào)：SH00064，拜耳醫(yī)藥上海有限公司)；氫氧化鋁凝膠、DAPI(美國(guó)Thermo公司)；小鼠OVA特異性IgE ELISA試劑盒(美國(guó)Biolegend公司)；小鼠IL-5、小鼠IL-13 ELISA試劑盒(臺(tái)灣Arigo公司)；兔抗小鼠p65抗體、兔抗小鼠IκB抗體(美國(guó)Cell Signal公司)；抗β-actin抗體(博士德公司)；細(xì)胞核蛋白與胞質(zhì)蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)；山羊抗小鼠免疫球蛋白G(IgG) (H+L)-HRP、山羊抗兔IgG(H+L)-HRP(三箭生物技術(shù)公司)；DyLight 549-羊抗兔IgG (H+L)(聯(lián)科生物公司)。

1.2儀器ECLIPSE TE2000-S型倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；Mini-PROTEAN Tetra Cell型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanno5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀(Tanno公司)；D3024R型微型高速冷凍離心機(jī)(賽洛捷克公司)；LSM800激光掃描共聚焦顯微鏡(Zeiss公司)。

2 方法

2.1過敏性哮喘小鼠模型的制備SPF級(jí)8周齡BALB/c ♀小鼠，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(合格證號(hào)：44005800005107)。分為正常組、模型組、兒茶素給藥組(75、150、300 mg·kg-1)、氯雷他定組(2 mg·kg-1)，每組6只。模型組與各給藥組于d 1、8、15腹腔注射25 μg OVA、1 mg氫氧化鋁完成基礎(chǔ)致敏，并在d 22～28，鼻部給予1 mg OVA激發(fā)[7]，正常組以相應(yīng)體積的PBS代替。在激發(fā)前30 min, 給藥組灌胃給予相應(yīng)的藥物(Fig 1)。

Fig 1 Allergic asthma model

an intraperitoneal injection of 25 μg of ovalbumin (OVA) and 1 mg of alum in 300 μL of phosphate-buffered saline. One week after the last OVA sensitization (day 21), a series of seven daily intranasal OVA(500 μg) challenges were administered.

2.2ELISA法檢測(cè)小鼠血清中OVA特異性IgE的含量取小鼠外周血于無菌EP管中，3 000 r·min-1，4℃離心10 min，得小鼠血清。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣孵育洗滌后，加入酶標(biāo)抗體孵育洗滌，加底物液顯色，終止反應(yīng)后，450 nm、570 nm檢測(cè)吸光度。

2.3血液分析儀分析小鼠外周血細(xì)胞的比例取50 μL小鼠外周血于無菌EP管中，加入5 μL肝素鈉混勻后，于獸用血液分析儀分析小鼠外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的比例。

2.4肺組織病理切片完成最后一次激發(fā)后24 h，脫頸椎處死小鼠，取出新鮮的組織，固定于4%多聚甲醛中。組織經(jīng)乙醇脫水、二甲苯透化后，石蠟包埋切片。切片用蘇木精、伊紅染色后，再次脫水透明，最后用中性樹膠封片。

2.5ELISA法檢測(cè)肺組織中TSLP、IL-5、IL-13的含量取30 mg左右新鮮組織，加入300 μL生理鹽水低溫勻漿1 min，4℃、5 000 r·min-1離心5 min，2次離心后，取上清得勻漿液，并用BCA試劑盒檢測(cè)其濃度。配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加樣孵育洗滌后，加入酶標(biāo)抗體孵育洗滌，加底物液顯色，終止反應(yīng)后，450 nm檢測(cè)吸光度。

2.6蛋白印跡法檢測(cè)肺組織中NF-κBp65、IκB蛋白的表達(dá)情況取30 mg新鮮組織，加入200 μL含1% PMSF的胞質(zhì)蛋白提取劑，低溫勻漿1 min，冰浴15 min，4℃、15 000×g離心5 min后，取上清得胞質(zhì)蛋白。PBS沖洗后，加入50 μL含1% PMSF的核蛋白提取劑，每1 min渦旋1次，渦旋10次，4℃、15 000×g離心5 min后，取上清得核蛋白。提取的蛋白用BCA試劑盒檢測(cè)其濃度，蛋白變性，以20 μg蛋白量計(jì)算上樣體積。電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，5% TBST清洗；加入一抗，4℃孵育過夜。5% TBST室溫清洗；加入二抗，室溫孵育1 h，5% TBST清洗二抗；ECL液顯色4 min后，拍照，圖像分析系統(tǒng)計(jì)算各泳道灰度值。

2.7免疫熒光檢測(cè)肺組織中NF-κBp65蛋白核轉(zhuǎn)錄情況取肺組織石蠟切片，60 ℃烘烤后，松節(jié)油、乙醇梯度脫蠟，枸櫞酸抗原修復(fù)。0.2% Triton X-100透化，10%山羊血清封閉，加入NF-κB p65抗體4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗，DAPI封片，激光共聚焦顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1兒茶素對(duì)過敏性哮喘小鼠血清中OVA特異性IgE的影響如Fig 2所示，給予兒茶素干預(yù)后，小鼠血清的OVA特異性IgE含量明顯減少(P<0.05)。

Fig 2 Level of OVA-specific IgE in serum of allergic asthma mice

*P<0.05vsmodel

Fig 3 Proportion of inflammatory cells in peripheral blood of allergic asthma mice

A: WBC; B: Gran; C: Lymphocyte; D: Monocyte.#P<0.05vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

3.2兒茶素對(duì)過敏性哮喘小鼠外周血細(xì)胞的影響如Fig 3所示，給予兒茶素干預(yù)后，哮喘小鼠外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞明顯減少(P<0.05)。

3.3兒茶素可明顯減少炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Fig 4的HE染色結(jié)果表明，哮喘小鼠肺組織中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，給予兒茶素后可明顯緩解這種癥狀。

3.4兒茶素可明顯降低哮喘小鼠肺組織TSLP、IL-5、IL-13的含量ELISA法檢測(cè)肺組織中TSLP及Th2炎癥因子的含量，如Fig 5所示，兒茶素可抑制肺組織中TSLP、IL-5、IL-13的上升(P<0.05或P<0.01)。

3.5兒茶素對(duì)過敏性哮喘小鼠肺組織NF-κBp65、IκB蛋白表達(dá)的影響Fig 6 Western blot結(jié)果表明，兒茶素可抑制NF-κB p65入核轉(zhuǎn)錄，并增加其調(diào)節(jié)因子IκB的表達(dá)。

Fig 4 Results of HE staining in lung(×200)

A: Control; B: Model; C: Catechin 75 mg·kg-1; D: Catechin 150 mg·kg-1; E: Catechin 300 mg·kg-1; F: Loratadine 2 mg·kg-1

Fig 5 Levels of TSLP (A), IL-5(B), IL-13(C) in lung tissues of allergic asthma mice

#P<0.05,##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.6兒茶素對(duì)過敏性哮喘小鼠肺組織NF-κBp65蛋白核轉(zhuǎn)錄的影響Fig 7結(jié)果表明，兒茶素可明顯抑制NF-κB p65核轉(zhuǎn)錄，核內(nèi)NF-κB p65的表達(dá)減弱。

4 討論

過敏性哮喘是一種常見的、以氣道炎癥為主要特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病。過敏性哮喘發(fā)病機(jī)制受過敏原、基因遺傳等因素的影響，臨床上常表現(xiàn)為不同淋巴細(xì)胞亞群的失平衡、嗜酸性粒細(xì)胞的氣道浸潤(rùn)、Th2細(xì)胞因子過度表達(dá)等。

Fig 6 Expression of NF-κB p65, IκB in mouse lung tissues by Western blot

A: NF-κB p65 and IκB in cytoplasm; B: NF-κB p65 in nucleus.##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel.

2型輔助性T細(xì)胞(Th2細(xì)胞)在過敏性鼻炎、過敏性哮喘等過敏反應(yīng)中起關(guān)鍵作用[8]，其分泌的Th2因子如IL-4、IL-5、IL-13，可促使嗜酸性粒細(xì)胞遷移至炎癥部位，并可誘導(dǎo)B細(xì)胞釋放IgE抗體。研究發(fā)現(xiàn)，TSLP是Th2型炎癥反應(yīng)的重要啟動(dòng)因素。塵螨等過敏原可刺激上皮細(xì)胞分泌TSLP因子，來源于上皮的TSLP可通過促進(jìn)樹突狀細(xì)胞OX40L與CD4+T細(xì)胞上的OX40結(jié)合, 進(jìn)而使CD4+T細(xì)胞向Th2亞群分化，上調(diào)Th2細(xì)胞因子的比例[9]。與此同時(shí)，Th2細(xì)胞因子IL-13又可刺激上皮細(xì)胞分泌TSLP，最終導(dǎo)致呼吸道炎癥的反復(fù)與難愈。

Fig 7 Nuclear transcription of NF-κB p65 in immunofluorescence

本研究通過ELISA法檢測(cè)肺部勻漿液中TSLP的含量，發(fā)現(xiàn)兒茶素可抑制TSLP的表達(dá)，且給藥組與模型組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在給予兒茶素干預(yù)之后，肺組織中IL-5和IL-13的含量同樣明顯降低。此外，兒茶素可以降低OVA所致的過敏性哮喘小鼠血清中OVA特異性IgE的含量及小鼠外周血中白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的比例，且在高劑量組中，這種差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過HE染色觀察肺組織局部病變，發(fā)現(xiàn)兒茶素同樣可以緩解肺組織中炎癥反應(yīng)，明顯減輕炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，提示兒茶素可能通過抑制TSLP的表達(dá)，緩解下游的炎癥反應(yīng)。

目前認(rèn)為，在過敏性炎癥中，細(xì)胞因子、微生物、環(huán)境過敏原等多種因素可刺激TSLP表達(dá)，而NF-κB信號(hào)通路可能是TSLP表達(dá)的重要調(diào)控機(jī)制[10]。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-1β可通過刺激NF-κB信號(hào)通路，誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞及角質(zhì)細(xì)胞分泌TSLP因子[11-12]；IκB激酶β(inhibitor kappa B kinase β,IKKβ) 缺失或NF-κB信號(hào)抑制劑干預(yù)，則減少上皮細(xì)胞表達(dá)TSLP[13]。亦有研究指出，兒茶素類化合物可通過抑制NF-κB信號(hào)通路，緩解大鼠的肝損傷[14]。故本研究考察了兒茶素對(duì)NF-κB信號(hào)通路活化的經(jīng)典途徑(IκBα降解、NF-κB p65入核)的干預(yù)作用[15]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兒茶素可抑制NF-κB p65進(jìn)入細(xì)胞核，并上調(diào)IκB水平，減輕炎癥反應(yīng)，有效地抑制NF-κB信號(hào)的活化。

綜上所述，兒茶素可有效地緩解OVA所致的過敏性哮喘小鼠的Th2炎癥反應(yīng)及其過敏癥狀，其作用可能是通過調(diào)控NF-κB通路，減少TSLP的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)主要在廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中醫(yī)藥免疫室完成，非常感謝本課題組的全體老師及同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)的指導(dǎo)和幫助。)

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