朱秋爽，梅仲秋，劉 濤，趙 軍，由淑萍

(1. 新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院，新疆 烏魯木齊 830011；2. 新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所維吾爾藥重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830004；3. 新疆醫(yī)科大學護理學院，新疆 烏魯木齊 830011)

目前，臨床上常用的抗炎藥物主要為非甾體抗炎藥，其療效明顯，但均存在潛在的副作用[1]。因此，尋找低毒高效的新型抗炎藥是藥物研究的一個重要課題。新疆圓柏(JuniperusSabina)為柏科圓柏屬植物常綠匍匐灌木，廣泛分布于新疆、甘肅和陜北的干旱荒山和沙地之中。據(jù)《維吾爾藥志》記載，新疆圓柏枝葉和果實常用于類風濕關(guān)節(jié)炎等疾病的治療[2]?；ㄉ南┧?arachidonic acid，AA)代謝途徑和細胞因子網(wǎng)絡(luò)是抗炎作用的重要靶點，也是類風濕關(guān)節(jié)炎治療藥物研發(fā)的關(guān)鍵所在。本實驗采用環(huán)氧合酶1/2(cyclooxygenase-1/2，COX-1/2)和5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，5-LO)抑制劑篩選試劑盒，對新疆圓柏枝葉中分離出的總黃酮、槲皮苷、異槲皮苷3種成分進行抗炎活性的初步篩選，同時采用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激小鼠RAW264.7巨噬細胞體外炎癥細胞模型，觀察新疆圓柏有效成分對促炎因子TNF-α的影響。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑新疆圓柏總黃酮、槲皮苷、異槲皮苷由新疆藥物研究所趙軍研究員建立高速逆流色譜分離純化并鑒定，實驗時用二甲基亞砜(DMSO)助溶，加DMEM培養(yǎng)基配制成所需濃度(DMSO濃度不超過5‰)；吲哚美辛(批號G160404，山西云鵬制藥)；胎牛血清(美國Gibco)；DMEM培養(yǎng)基(以色列BI)；脂多糖(美國Sigma )；TNF-α ELISA 試劑盒(美國USCN)；COX(Item No.701050)、Lipoxygenase(Item No.760700)試劑盒均購自美國Cayman。

1.2COX-1/2、5-LO酶體外抗炎活性篩選COX-1篩選實驗中設(shè)空白組(BC)、對照組(NC)、總黃酮(Fla 12.5、25、50、100 mg·L-1)、異槲皮苷(IQ 25、50、100、200 mg·L-1)和槲皮苷(Q 25、50、100、200 mg·L-1)共14組；COX-2篩選實驗中設(shè)空白組、對照組、總黃酮(12.5～200 mg·L-1)、異槲皮苷(6.25～100 mg·L-1)和槲皮苷(6.25～100 mg·L-1)共17組；5-LO篩選實驗中設(shè)空白組、對照組、總黃酮、異槲皮苷和槲皮苷(12.5～200 mg·L-1)共17組。所有操作嚴格按說明書進行，最后計算抑制率及IC50。抑制率=[(OD對照組-OD處理組)/(OD對照組- OD空白組)]×100%。

1.3MTT法檢測總黃酮、槲皮苷對RAW264.7巨噬細胞的毒性作用設(shè)空白組、對照組、總黃酮和槲皮苷(12.5～200 mg·L-1)共12組，每組5復孔。調(diào)整細胞密度為1×109·L-1，每孔加入100 μL細胞混懸液，于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)24 h后，小心吸棄培養(yǎng)基，除空白組、對照組外，每孔分別加入含有不同濃度的藥物培養(yǎng)基。分別于24、48、72 h時加入20 μL MTT(5 g·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。傾去培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO 溶解，在 490 nm處測吸光度，重復3 次。計算細胞抑制率。

1.4MTT法檢測總黃酮、槲皮苷對LPS誘導RAW264.7巨噬細胞的毒性作用設(shè)空白組、對照組、LPS組、LPS+不同濃度(12.5～200 mg·L-1)藥物組，共13組，每組5復孔。細胞培養(yǎng)24 h后，小心吸棄培養(yǎng)基，除空白組、對照組、LPS組添加原培養(yǎng)基外，其余各組每孔分別加入含有不同終濃度的藥物培養(yǎng)基，預處理2 h后，除空白組、對照組外，其余各組均加入終濃度為1 mg·L-1的LPS。分別于24、48 h時處理，方法同上。

1.5總黃酮、槲皮苷對LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響實驗分組在細胞毒性分組的基礎(chǔ)上，增加LPS+吲哚美辛(10 mg·L-1)陽性對照組(PC)，共14組，每組2個復孔。采用ELISA雙抗夾心法檢測上清液中TNF-α水平。

2 結(jié)果

2.1COX-1/2、5-LO酶活性篩選對COX-1/2的抑制作用大小依次為總黃酮、異槲皮苷、槲皮苷；對5-LO的抑制作用大小依次為槲皮苷、總黃酮、異槲皮苷。

2.2總黃酮、槲皮苷對RAW264.7細胞及對LPS誘導的RAW264.7細胞的毒性作用總黃酮和槲皮苷對RAW264.7細胞或是誘導后細胞的半數(shù)毒性濃度(TC50)均超過200 mg·L-1。

2.3總黃酮、槲皮苷對LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響Tab 1結(jié)果顯示，1 mg·L-1LPS誘導RAW264.7細胞，TNF-α的分泌水平明顯高于正常細胞組(P<0.01)，表明已成功構(gòu)建RAW264.7細胞炎癥反應模型?？傸S酮、槲皮苷干預24、48 h，LPS誘導RAW264.7細胞分泌TNF-α受到不同程度抑制，量效關(guān)系明顯(P<0.01)。在相同刺激條件下，培養(yǎng)24、48 h時，總黃酮(50 ～ 200 mg·L-1)、槲皮苷(50 ～ 200 mg·L-1)抑制TNF-α分泌的效果優(yōu)于陽性對照吲哚美辛(10 mg·L-1)(P<0.01，P<0.05)，槲皮苷(25 ～ 200 mg·L-1)抑制TNF-α分泌效果優(yōu)于總黃酮。

Tab 1 Effect of flavonoids, quercitrin on excretion of TNF-αin RAW264.7 macrophages stimulated by LPS(±s, n=5)

**P<0.01vsNC;▲▲P<0.01vsLPS;△P<0.05,△△P<0.01vsPC+LPS;#P<0.05vsFla+LPS

3 討論

研究表明，COX-1為組成型酶，維持正常生理功能，若抑制COX-1，則可能導致胃黏膜等的損害[3]。因此，本實驗有選擇性地篩選對COX-1抑制作用弱，對COX-2/5-LO抑制作用強的雙重抑制劑。實驗結(jié)果顯示，槲皮苷對COX-1抑制作用最弱；在COX-2代謝途徑中，總黃酮表現(xiàn)出對COX-2的強抑制活性，這可能與異槲皮苷和槲皮苷在該途經(jīng)中起到協(xié)同作用有關(guān)，而異槲皮苷對COX-2的抑制活性較槲皮苷明顯，有可能與兩者結(jié)構(gòu)，尤其是糖苷與其對應的糖苷配基的不同有關(guān)[4]。在5-LO代謝途徑中，槲皮苷起主要抑制作用，此結(jié)果與Ribeiro等[5]認為槲皮苷是良好的5-LO抑制藥結(jié)論相符。細胞實驗中，ELISA法檢測TNF-α結(jié)果表明，在相同條件刺激下，槲皮苷25 ～ 200 mg·L-1濃度組在24、48 h時的抑制效果較總黃酮明顯。由此可推測，槲皮苷通過下調(diào)COX-2/5-LO活性，減少炎癥介質(zhì)的分泌，達到抗炎的效果，加之其毒性作用小，有望成為具有明顯抗炎活性的先導化合物，為揭示新疆圓柏抗炎作用以及其抗類風濕性關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)提供了理論依據(jù)。

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