韓 琳，王洪新，魯美麗

(錦州醫(yī)科大學心腦血管藥物研究重點實驗室，遼寧 錦州 121001)

心肌細胞凋亡是指心肌細胞程序性自主死亡。近年研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激、缺血/再灌損傷等可誘導(dǎo)細胞凋亡[1-2]，在各種心血管疾病的發(fā)病機制和預(yù)后中發(fā)揮重要作用。所以，抗心肌細胞凋亡對心臟疾病的治療是一個重要的靶點。促分裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，MAPKs)通路是真核細胞調(diào)控介導(dǎo)細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要系統(tǒng)，參與動物細胞的增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)化等生物學反應(yīng)，包括ERK、JNK、p38 MAPK 以及 ERK5/BMK1四條途徑[3]。通常情況下，ERK起保護細胞作用，而JNK和p38 MAPK則表現(xiàn)為促凋亡作用[4]。當JNK被不同的刺激因子激活后，其轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，激活其下游作用底物——核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子(c-Jun)，并磷酸化。研究發(fā)現(xiàn)，c-Jun大量磷酸化可導(dǎo)致細胞凋亡和分化[5]。ASK1-MKK4/7-JNK信號通路可以激活細胞氧化應(yīng)激通路，調(diào)控NF-κB的活性，使一氧化氮(NO)的生成增加，誘導(dǎo)細胞損傷[6]。NF-κB是核轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)節(jié)炎癥因子、誘導(dǎo)酶、趨化因子等，在免疫、炎癥、凋亡中發(fā)揮重要作用[7]。NF-κB既可調(diào)節(jié)其下游的促炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表達,又可被其反饋激活，進而放大炎癥反應(yīng)，上調(diào)NF-κB的表達，誘導(dǎo)細胞凋亡[8]。

黃芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)是黃芪的主要活性成分之一，研究發(fā)現(xiàn)，APS具有免疫促進劑或調(diào)節(jié)劑及增強機體抵抗力的作用，尤其具有保護心肌的作用[9]?，F(xiàn)已證實，脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)能刺激NF-κB和JNK信號通路的活化[10]，且本實驗室前期實驗已證明APS可抑制心肌細胞凋亡[11]，但其具體機制尚不明確。本研究采用LPS誘導(dǎo)小鼠心肌細胞凋亡，通過檢測相關(guān)凋亡因子表達水平及其在心肌組織中的浸潤情況，闡明APS通過抑制NF-κB和JNK信號通路減輕LPS誘導(dǎo)的小鼠心肌細胞凋亡。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑黃芪多糖，南京景竹生物技術(shù)有限公司，批號JZ150206A，APS純度為98%；LPS，購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；TUNEL試劑盒購自Roche公司；IL-β、TNF-α ELISA試劑盒購自R&D公司；一抗p-JNK、JNK、IκB-α、Bcl-2、caspase-3、β-actin均購自ABclonal公司；Bax抗體購自Proteintech公司；HRP山羊抗兔IgG(H+L)、NF-κB購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠IgG(H+L)、ECL化學發(fā)光顯色試劑盒、BCA試劑盒、細胞質(zhì)細胞核蛋白提取試劑盒、FITC標記山羊抗兔IgG(H+L)，均購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；胰蛋白酶、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)均購自美國 Sigma公司；高糖DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；小牛血清購自美國 Hyclone公司。

1.2實驗動物與細胞♂ SPF級昆明小鼠40只，7周齡，體質(zhì)量(20±2)g，由錦州醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK2014-0004。H9c2細胞株購自武漢博士德生物有限公司。

1.3儀器DMI 3000B 倒置顯微鏡(德國Leica公司)；凝膠成像儀、電泳儀、電泳槽、轉(zhuǎn)印機(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)；小動物超聲影像系統(tǒng)Prospect3.0(臺灣S-Sharp公司)；超凈工作臺(江蘇吳縣市凈化技術(shù)研究所)；CO2孵箱(美國Sheldon Manufacturing Inc公司)。

1.4方法

1.4.1動物實驗分組 SPF級昆明小鼠40只，隨機分為空白對照組、模型組、APS(200、400、800 mg·kg-1)組，每組8只，對照組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。14 d后，給藥組和模型組腹腔注射LPS(10 mg·kg-1)，8 h后進行下一步實驗。

1.4.2H9c2心肌細胞的培養(yǎng) 用含15%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。至密度90%左右時傳代，以2×107·L-1濃度接種6孔板，約48 h后換液1%胎牛血清16 h，進行誘導(dǎo)分化后開始實驗。實驗所需藥品APS為水溶性，以三蒸水溶解后，用0.22 μm針式濾器過濾除菌；APS預(yù)先孵育30 min后，加入1 mg·L-1LPS，24 h后進行各指標的測定。實驗共分為5組：空白對照組、LPS模型組(1 mg·L-1)、APS低、中、高劑量組(10、25、50 mg·L-1)。

1.4.3超聲心動檢測心臟情況 對照組和模型組給予同等劑量的生理鹽水灌胃。14 d后，給藥組和模型組腹腔注射脂多糖10 mg·kg-1，8 h后，小鼠吸入麻醉，超聲心動測左心室射血分數(shù)(ejection fraction,EF)、左心室縮短分數(shù)(fractional shortening,FS)、搏出量(stroke volume,SV)、心輸出量(cardiac output，CO)。

1.4.4ELISA法檢測IL-1β、TNF-α水平 小鼠摘眼球取血于EP管中，常溫下靜置2 h，析出血清后，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液。根據(jù)試劑盒說明書操作，酶標495 nm波長處測定吸光度(OD)值。

1.4.5TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡 取心肌組織常規(guī)固定，冰凍切片，用PBS沖洗30 min，甩干后3%過氧化氫-甲醇處理10 min，PBS浸洗3次，每次5 min，然后在冰上進行如下操作：0.1% Triton X-100、0.1%檸檬酸鈉溶液處理2 min，PBS浸洗2次，每次5 min，TUNEL反應(yīng)混合液37℃孵育1 h，PBS浸洗3次。吸凈PBS，用熒光顯微鏡進行觀察。

1.4.6細胞核細胞質(zhì)蛋白的提取 將心肌組織碾碎成細小碎片，按照20 ∶1的比例混合細胞質(zhì)蛋白抽提試劑A和B，加入PMSF配制成終濃度為1 mmol·L-1的混合液，每60 mg的組織中加入200 μL勻質(zhì)液，冰浴放置15 min，15 000 r·min-1離心5 min，把上清移至EP管中，此為細胞質(zhì)蛋白。每20 μL的細胞沉淀再加入200 μL細胞質(zhì)蛋白抽提試劑A，超聲10 s,冰浴15 min，加入細胞質(zhì)蛋白抽提試劑B，超聲10 s,冰浴1 min，再超聲10 s,4℃、15 000 r·min-1離心5 min，吸取上清液，此為細胞質(zhì)蛋白。然后將沉淀加入細胞核蛋白抽提劑，最高渦速30 s,冰浴2 min，再次渦速30 s，共30 min，然后4℃、15 000 r·min-1離心10 min,取上清液，此為細胞核蛋白。貼壁細胞用細胞刮子刮下并用移液器吹打，離心收集，然后實驗方法與上述相同。

Tab 1 Effects of APS on LPS-induced hemodynamics in mice(±s,n=8)

EF: Left ventricular ejection fraction; FS: Left ventricular shortening score; SV: Stroke volume; CO: Cardiac output.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

1.4.7Western blot檢測 取冷凍心肌組織100 mg和心肌細胞懸液200 μL，加入1 mL蛋白裂解液，用超聲細胞破碎儀于冰上超聲，4℃、12 000 r·min-1離心10 min，將離心后的上清BCA法測定蛋白含量。SDS-PAGE凝膠電泳，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上。10%的BSA室溫封閉2 h后，分別加IκB-α(1 ∶1 000)、NF-κB (1 ∶500)、p-JNK(1 ∶1 000)、JNK(1 ∶1 000)、Bax(1 ∶5 000)、Bcl-2(1 ∶1 000)、caspase-3(1 ∶1 000)、 Lamin-B(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶5 000)一抗，孵育過夜。然后加入HRP標記的羊抗小鼠二抗(1 ∶5 000)，室溫孵育l.5 h，ECL發(fā)光劑顯色發(fā)光，生物發(fā)光成像分析儀檢測分析。

2 結(jié)果

2.1APS對小鼠心功能的影響超聲心動圖結(jié)果顯示，不同濃度的APS能有效地防止LPS引起的心肌功能的減退，其作用存在劑量依賴性。如Tab 1所示，與正常組相比，模型組的EF和FS都明顯降低，模型組心肌收縮功能明顯改變(P<0.01)；與模型組相比，APS(400、800 mg·kg-1)處理組EF和FS明顯恢復(fù)(P<0.01)。

2.2APS對血清TNF-α、IL-1β水平的影響TNF-α、IL-1β是促炎癥因子，它們可以被LPS誘導(dǎo)，并激活NF-κB和JNK信號通路，進而引起心肌細胞凋亡。Tab 2的ELISA結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)后TNF-α、IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，APS (400、800 mg·kg-1)能有效抑制LPS刺激后TNF-α、IL-1β水平的升高，其作用呈劑量依賴性(P<0.01)。

2.3APS對心肌細胞凋亡的影響如Fig 1所示，與正常對照組相比，LPS組細胞凋亡明顯增加(P<0.01)。與LPS組相比，APS (400、800 mg·kg-1)干預(yù)后能明顯降低凋亡(P<0.01)，而APS 200 mg·kg-1組的凋亡率與LPS組比較無差別。

Fig 1 Effect of APS on cardiomyocyte apoptosis(×200)

Tab 2 Effects of APS on contents of TNF-α and

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

2.4APS對LPS誘導(dǎo)的JNK通路的影響APS是否通過JNK信號通路而抑制心肌細胞凋亡呢？在體內(nèi)與體外實驗中，與正常對照組相比，LPS組p-JNK明顯升高(P<0.01)；與LPS組相比，APS中、高劑量組p-JNK明顯降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性，而JNK則沒有明顯變化(Fig 2)。

2.5APS對LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的影響Fig 3 Western blot結(jié)果表明，在體內(nèi)與體外實驗中，LPS處理后細胞質(zhì)中的IκB-α、NF-κB蛋白表達降低(P<0.01)，而細胞核中NF-κB的表達增高(P<0.01)； APS中、高劑量可明顯抑制IκB-α降解和NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移(P<0.05)。提示APS對LPS誘導(dǎo)的IκB-α的降解和NF-κB向核內(nèi)轉(zhuǎn)移有抑制作用。

2.6APS對Bcl-2、caspase家族的影響Fig 4結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組Bax、caspase-3蛋白表達明顯增高，而Bcl-2表達降低(P<0.01)；APS中、高劑量組中Bax、caspase-3的蛋白表達明顯降低，Bcl-2表達增高(P<0.01)。提示APS對caspase家族、Bax蛋白表達有抑制作用，而促進Bcl-2蛋白表達。

3 討論

心肌細胞凋亡與許多心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)聯(lián)。Bcl-2特異性抑制細胞凋亡的主要機制是其在線粒體水平上與Bid、Bim或Bad結(jié)合,卻與Bax或Bak解離,從而維護線粒體膜的完整性,因而防止膜間隙中凋亡蛋白的滲出;同時還可以抑制Ca2+的釋放,降低線粒體對Ca2+的攝取,從而抑制心肌細胞凋亡。另外,Bcl-2還能直接與凋亡蛋白活性因子-1(Apaf-1)結(jié)合,形成Bcl-2/ Apaf-1/caspase-9復(fù)合物,也能阻斷caspase的始動激活[12]。caspase-3是caspase家族在心肌細胞凋亡過程中重要的蛋白酶、多種凋亡途徑的共同下游效應(yīng)因子、心肌細胞凋亡蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路，可直接誘導(dǎo)細胞凋亡。本研究中，LPS模型組心肌組織中Bcl-2降低, Bax、caspase-3的蛋白表達增加。而APS中、高劑量組均可增加Bcl-2表達，降低Bax、caspase-3的蛋白表達。表明APS可以對抗LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡，對心臟起保護作用。

Fig 2 Effect of APS on LPS-induced JNK pathway in vivo and in vitro(±s,n=8)

A: The protein levels of JNK and p-JNK were measured by Western blotinvivoexperiments; B: The protein levels of JNK and p-JNK were measured by Western blotinvitroexperiments.**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

Fig 3 Effect of APS on LPS-induced NF-κB signaling pathway in vivo and in vitro(±s,n=8 )

The contents of IκB-α and NF-κB protein in cytoplasm of cardiomyocyte induced by LPS-induced myocardiuminvivo(A) andinvitro(B); APS inhibited the content of NF-κB protein in LPS-induced nuclearinvivo(C) andinvitro(D).**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsLPS model.

既往研究顯示，NF-κB和JNK信號通路可以誘導(dǎo)心肌細胞凋亡[13-14]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)是MAPKs家族成員，在細胞凋亡中也是重要的信號通路,當其受到外界刺激后，JNKK1/MKK4/SEK1或者JNKK2/MKK7介導(dǎo)JNK上Thr183和Tyr185位點磷酸化，使JNK完全活化并具有酶催化活性[7]。而當JNK被活化后，其轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，并使它主要的下游作用物c-Jun磷酸化，激活依賴于轉(zhuǎn)錄的凋亡信號通路[15]。p-JNK誘導(dǎo)心肌細胞凋亡可能的機制是既可促進多種凋亡蛋白的表達,又可通過線粒體水平發(fā)揮其有效抗凋亡作用,還可作用于Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak等，誘導(dǎo)細胞色素釋放入細胞質(zhì)內(nèi),從而激活細胞凋亡的起始[12]。本實驗體內(nèi)、體外研究中，APS中、高劑量組可以明顯降低JNK蛋白的磷酸化，表明APS對抗LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡可能與JNK信號通路有關(guān)。

Fig 4 Effects of APS on Bcl-2 and caspase

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsLPS model

NF-κB是一個轉(zhuǎn)錄因子，在炎癥、凋亡等細胞生理活動中發(fā)揮重要作用。NF-κB的活化可被炎癥因子IL-1β、TNF-α激活，進而引起一系列的心肌損傷。NF-κB既可以調(diào)節(jié)IL-1β、TNF-α等炎癥因子的釋放，又可以被其反饋調(diào)節(jié)。IκB是一個分子復(fù)合物，當IκB被激活磷酸化后，NF-κB p65/50異源二聚體從復(fù)合物IκB中脫落，并從細胞質(zhì)進入細胞核，誘導(dǎo)細胞凋亡。我們研究發(fā)現(xiàn)，APS中、高劑量組可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的IκB磷酸化和隨后的降解，而且阻止NF-κB p65/50進入細胞核，并使其下游細胞因子IL-1β、TNF-α釋放減少。所以我們推斷，APS可能通過抑制信號通路NF-κB來抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

綜上所述，LPS通過活化NF-κB和JNK信號通路誘導(dǎo)心肌細胞凋亡，APS減少LPS所致心肌細胞凋亡的機制可能與抑制NF-κB和JNK信號通路有關(guān)。本實驗部分揭示了APS的作用機制，并且為心血管疾病的治療提供了新的靶點，為尋找新的治療藥物提供了新的思路。

(致謝: 本實驗完成于錦州醫(yī)科大學心腦血管藥物研究重點實驗室，實驗過程中得到該實驗室全體老師的指導(dǎo)及同學的協(xié)助，在此表示感謝。)

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