王藝儒，唐德志，梁倩倩，徐 浩，趙永見，鄭為超

(1. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2. 筋骨理論與治法教育部重點實驗室，上海 200032；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032)

頸椎病發(fā)病率逐年上升，發(fā)病趨于年輕化，已成為威脅成年人健康的主要疾病之一，給患者的工作生活帶來了嚴(yán)重不便。頸椎病的主要病理基礎(chǔ)是椎間盤退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)，中醫(yī)認為，“氣虛血瘀”是椎間盤退變的病機[1]。迄今為止，IVDD的病理機制仍不十分清楚。前期體外實驗已證明，桃仁、紅花中主要單體苦杏仁苷及羥基紅花黃色素A可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細胞退變[2-5]。王擁軍等[6]首次建立的動靜力失衡性椎間盤退變大鼠模型是研究IVDD常用的動物模型。本文主要探討中藥經(jīng)典活血化瘀藥對桃仁-紅花，對動靜力失衡性椎間盤退變大鼠軟骨胞外基質(zhì)的影響及對IVDD的治療作用，為頸椎病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實驗動物Wistar ♂大鼠50只，清潔級，8周齡，平均體質(zhì)量210 g左右 ，購自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，許可證：SYXK(滬)2015-0008，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心，自由飲水?dāng)z食。

1.2藥物與試劑中藥桃仁、紅花，購自龍華醫(yī)院中藥房；鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè))；II型膠原(type II collagen，Col II )兔抗鼠多克隆抗體(BA0533)、X型膠原(type X collagen，Col X )兔抗鼠多克隆抗體(BA2023)、即用型山羊抗兔SABC免疫組化染色試劑盒，均購自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol(美國Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(RR420A)購自TaKaRa公司；Col II、Col X、β-actin引物均由北京華大基因公司合成；阿爾新藍(Alcian blue)、蘇木精(Hematoxylin)、伊紅(Eosin Y)、Orange G、Phloxin B，均購自美國Sigma公司。

1.3儀器TP1020全自動組織脫水機、EG1160石蠟包埋機、RM2235石蠟切片機(德國Leica)；BX50激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)；C1000 Thermal Cycler實時定量PCR儀(美國Bio-Rad)；Centrifuge 5417R高速離心機(德國Eppendorf)。

1.4方法

1.4.1動物的分組及模型的建立 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，編為1～50號，采用隨機數(shù)字表法分組，每組10只。分為對照組、模型組、假手術(shù)組、美洛昔康組、桃仁-紅花藥對組，編號后分籠飼養(yǎng)。動靜力失衡性大鼠椎間盤退變模型參考王擁軍等[6]的方法造模：將大鼠(模型組、美洛昔康組、桃仁-紅花藥對組)進行鹽酸氯胺酮腹腔注射麻醉，麻醉用量0.1 g·kg-1，剪除大鼠頸后部毛，碘伏消毒后，由頸后正中做2～2.5 cm長縱向切口，切開皮膚，各層肌肉充分游離，橫向切斷頭、頸、寰最長肌以及深層頸夾肌，將頸髂肋肌和頭半棘肌完全切除，依次剪斷C2～C7椎間盤的棘上和棘間韌帶。徹底止血，慶大霉素沖洗后縫合皮膚，紅霉素軟膏外涂切口，防止感染。假手術(shù)組切開皮膚后不做任何處理，慶大霉素沖洗后直接縫合，切口處涂紅霉素軟膏。

1.4.2動物給藥 術(shù)后12周，各給藥組開始灌胃30 d，用藥劑量根據(jù)《實驗動物藥理學(xué)》中動物表面積比率換算計量法計算。按照成年人每日用藥劑量標(biāo)準(zhǔn)換算(成年人按標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg計算，大鼠平均體質(zhì)量按370 g計算)，得出大鼠給藥劑量。桃仁-紅花煎劑以及雙蒸水溶解的美洛昔康懸濁液按劑量每日1次灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d。模型組于造模后與對照組及假手術(shù)組按照同等劑量生理鹽水灌胃30 d。

1.4.3標(biāo)本處理 大鼠于給藥30 d后全部處死，取C4/5、C6/7椎間盤標(biāo)本， C6/7椎間盤置于-80℃冰箱保存。C4/5椎間盤置于質(zhì)量濃度為40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h，清水沖洗30 min，質(zhì)量濃度為140 g·L-1的EDTA溶液脫鈣4周，每2 d換1次脫鈣液，脫水處理后石蠟包埋，5 μm正中矢狀位連續(xù)切片。

1.4.4ABOG染色 每個標(biāo)本抽取2張切片脫蠟至水，Alclan Blue /Hematoxylin混合染液30 min，鹽酸乙醇分化3 s，氨水返藍15 s， Eosin Y/Orange G/Phloxin B混合染液1.5 min，乙醇梯度脫水后二甲苯透明，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察椎間盤組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4.5免疫組化染色 每個標(biāo)本隨機抽取2張進行脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2滅活過氧化物酶15 min，BSA封閉10 min，一抗4 ℃孵育過夜，SABC 10 min后DAB顯色，蘇木精1 min染核，鹽酸乙醇分化5 s后氨水返藍，中性樹膠封片，顯微鏡下觀察Col II、Col X的表達。

1.4.6實時定量PCR檢測 提取總mRNA：分離C6/7椎間盤軟骨終板，置于研缽中加液氮研磨至粉末，加入1 mL TRIzol混勻，冰上靜置5 min，加氯仿200 μL后震蕩，冰上靜置20 min，14 000 r·min-1、4℃離心15 min，吸上清，加入500 μL預(yù)冷異丙醇，冰上靜置10 min，14 000 r·min-1、4℃離心15 min，棄上清，加體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇500 μL洗滌，9 200 r·min-1、4℃離心5 min，室溫靜置10 min，空氣干燥RNA沉淀后溶解于30 μL DEPC水，測RNA濃度；逆轉(zhuǎn)錄cDNA：配20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，于30℃孵育15 min，85℃ 5 s，終止反應(yīng)；實時定量PCR檢測mRNA表達：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，RNase-free 水7 μL，上、下游引物(引物序列見Tab 1)各1 μL，模板cDNA 1 μL，配制20 μL的反應(yīng)體系。95 ℃預(yù)變性3 min，進入循環(huán)，95℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸30 s的條件下循環(huán)擴增，循環(huán)次數(shù)均為40次。同一樣本同時做β-actin內(nèi)參PCR反應(yīng)，設(shè)置3個復(fù)孔。待反應(yīng)結(jié)束后，以每個樣本所含檢測的基因mRNA的拷貝數(shù)和其對應(yīng)的β-actin內(nèi)參基因的拷貝數(shù)的比值進行比較 。

Tab 1 Primer sequence of qPCR

2 結(jié)果

2.1桃仁-紅花藥對對椎間盤組織形態(tài)學(xué)的影響對照組C4/5椎間盤ABOG染色展現(xiàn)清晰的椎間盤界限，椎間盤中央?yún)^(qū)髓核可見清晰的基質(zhì)。模型組染色呈現(xiàn)出椎間盤退變的表現(xiàn)，椎間盤高度降低(Fig 1)，髓核基質(zhì)減少，纖維環(huán)出現(xiàn)環(huán)形裂隙，軟骨界限模糊、基質(zhì)丟失，并出現(xiàn)軟骨終板骨化，其中含骨髓樣組織。而假手術(shù)組、美洛昔康組及桃仁-紅花藥對組椎間盤髓核及軟骨與對照組相近(Fig 2)。

2.2桃仁-紅花藥對對軟骨終板細胞ColII、ColX蛋白表達的影響Col II主要表達于軟骨細胞基質(zhì)中，模型組Col II染色強度明顯低于對照組，而桃仁-紅花藥對組Col II表達高于模型組。Col X于軟骨細胞基質(zhì)中表達，模型組可見Col X陽性染色，對照組及桃仁-紅花藥對組Col X表達明顯少于模型組(Fig 3)。

Fig 1 Height of intervertebral disc

**P<0.01vsmodel

Fig2ThemorphologicalchangesofratintervertebraldiscbyABOGstaining(×200)

A: Control group; B: Model group; C: Sham group; D: Meloxicam group; E: Taoren-Honghua group

2.3桃仁-紅花藥對對軟骨終板細胞ColII、ColXmRNA表達的影響如Fig 4所示，與對照組相比，模型組椎間盤軟骨細胞中Col II表達降低，Col X表達升高。與模型組比較，桃仁-紅花藥對組椎間盤軟骨細胞中Col II表達上調(diào)，Col X表達下調(diào)。

Fig 3 Col II and Col X expression levels in rat degeneratedintervertebral discs by immunohistochemistry

A: The positive cells were measured by DAB and observed by microscopy(×200). a: Control group; b: Model group; c: Sham group; d: Meloxicam group; e: Taoren-Honghua group; B: Positive cell counts of Col II and Col X in per sight.**P<0.01vsmodel.

Fig 4 The relative expression of Col II (A) and Col X (B) mRNA

**P<0.01vsmodel

3 討論

中醫(yī)理論認為椎間盤退變的根本原因是“氣虛血瘀，本虛標(biāo)實”，益氣化瘀的方劑及拆方對椎間盤退變有一定的治療效果。中國藥典提示，桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘、潤腸通便之功效，紅花兼散瘀止痛、活血通經(jīng)之功效[7]。桃仁-紅花藥對最早出自清·吳謙《醫(yī)宗金鑒·四十四卷》中的方劑桃紅四物湯，是中藥治療活血化瘀類疾病的經(jīng)典配伍。通過對桃仁-紅花藥對在中藥方劑中應(yīng)用規(guī)律的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)兩味藥比例1 ∶1出現(xiàn)的頻次最多，對臨床用藥有重要指導(dǎo)意義[8]。

椎間盤是人體中最大的無血管組織，主要靠纖維環(huán)外周通路以及軟骨終板通路進行營養(yǎng)的供給和廢物的代謝，軟骨終板胞外基質(zhì)的生成與維持直接影響椎間盤的生物化學(xué)及生物力學(xué)功能。Col II是組成固體基質(zhì)的最主要部分，其含量直接影響胞外基質(zhì)的生物學(xué)功能[9]，而Col X特異表達于肥大軟骨細胞中，與基質(zhì)降解相關(guān)[10]。胞外基質(zhì)合成減少及降解加速是導(dǎo)致軟骨細胞退變的重要原因之一，軟骨細胞的退變在椎間盤退變進程中發(fā)揮重要作用[11-12]。

本研究通過建立動靜力失衡性椎間盤退變大鼠模型，運用 ABOG染色分析桃仁-紅花藥對煎劑對椎間盤退變中軟骨終板細胞外基質(zhì)產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，桃仁-紅花藥對組軟骨終板基質(zhì)染色較深，表明其胞外基質(zhì)含量較高，證明桃仁-紅花藥對可有效抑制退變椎間盤中軟骨細胞外基質(zhì)的降解。免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)，模型組能夠明顯上調(diào)Col X的表達，同時下調(diào)Col II的表達，桃仁-紅花藥對組能抑制Col X的表達，同時上調(diào)Col II的表達。因此，進一步采用實時定量PCR檢測各組Col II、Col X mRNA表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組Col X mRNA表達明顯增加，Col II mRNA表達明顯減少，桃仁-紅花藥對組能夠明顯下調(diào)Col X mRNA表達，上調(diào)Col II mRNA表達。我們可以得出，桃仁-紅花藥對可以減少動靜力失衡性椎間盤退變大鼠椎間盤軟骨基質(zhì)的降解，抑制軟骨細胞退變，進而延緩椎間盤退變，起到了椎間盤保護作用。

頸椎病的預(yù)防及早期干預(yù)越來越受到重視，活血化瘀類中藥用于臨床延緩頸椎病早期椎間盤退變的療效亟待探索，而該藥對能否有效防治腰椎疾病、骨關(guān)節(jié)炎等其他慢性骨關(guān)節(jié)病也是值得我們未來深入研究的課題。

(致謝：本實驗在上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所筋骨理論與治法教育部重點實驗室完成，感謝實驗室老師給予的技術(shù)指導(dǎo)以及實驗室同學(xué)給予的大力幫助。)

[1] 黃曉濤, 呂存賢, 馬鎮(zhèn)川, 等. 益氣活血法在治療腰椎間盤相關(guān)疾病中的作用[J]. 中國中醫(yī)骨傷科雜志, 2010,18(12):66-8.

[1] Huang X T, Lyu C X, Ma Z C, et al. The effect of Qi benefiting and blood activating method on the treatment of lumbar intervertebral disc related diseases[J].ChinJTraditMedTraumatolOrthop, 2010,18(12):66-8.

[2] 牛 凱, 趙永見, 姚長風(fēng), 等. 苦杏仁苷對IL-1β誘導(dǎo)后大鼠椎間盤軟骨終板細胞的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報,2013,29(12):1725-30.

[2] Niu K, Zhao Y J, Yao C F, et al. Effects of amygdalin on the endplate chondrocytes induced by IL-1β derived from rats’intervertebral discs[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(12):1725-30.

[3] 鄭為超, 牛 凱, 趙永見, 等. 苦杏仁苷對IL-1β誘導(dǎo)后大鼠椎間盤軟骨終板細胞凋亡的影響[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2014,30(12):1734-9.

[3] Zheng W C, Niu K, Zhao Y J, et al. Effect of amygdalin on end-plate chondrocytes apoptosis induced by IL-1β derived from rat intervertebral discs[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(12):1734-9.

[4] 牛 凱, 趙永見, 張 雷, 等. 苦杏仁苷聯(lián)合羥基紅花黃色素A對IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤軟骨終板細胞的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 2014,49(8):1136-42.

[4] Niu K, Zhao Y J, Zhang L, et al. The synergistic effect of amygdalin and HSYA on the IL-1β induced endplate chondrocytes of rat intervertebral discs[J].ActaPharmSin, 2014,49(8):1136-42.

[5] 牛 凱, 李晨光, 袁 松, 等. 桃仁-紅花藥對抑制IL-1β誘導(dǎo)椎間盤軟骨終板細胞發(fā)生退變的體外實驗研究 [J]. 中國藥學(xué), 2016,25(8):590-7.

[5] Niu K, Li C G, Yuan S, et al. TRHH-herb pair prevents IL-1β-induced degeneration of endplate chondrocytesinvitro[J].JChinPharmSci, 2016,25(8):590-7.

[6] 王擁軍, 施 杞, 沈培芝, 等. 動靜力失衡性大鼠頸椎間盤退變模型的動態(tài)觀察[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2001,21(3):199-202.

[6] Wang Y J, Shi Q, Shen P Z，et al. Dynamic observation on imbalance of dynamic and static forces and degenerated cervical intervertebral disc in rats[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2001,21(3):199-202.

[7] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015版，一部.

[7] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People’s Republic of China[S]. Beijing: China Medical Science Press，2015.

[8] 黃 潔, 馬榮華, 聞曉東, 等. 桃仁-紅花藥對不同配比的應(yīng)用數(shù)據(jù)分析[J]. 中國新藥雜志, 2012,21(4):407-11.

[8] Huang J, Ma R H, Wen X D, et al. Data analysis for different proportions of persicae semen and carthami flos in Chinese medicinal formulae[J].ChinJNewDrugs, 2012,21(4):407-11.

[9] Mahmoudifar N, Doran P M. Chondrogenesis and cartilage tissue engineering: the longer road to technology development[J].TrendsBiotechnol, 2012,30(3):166-76.

[10] Aigner T, McKenna L. Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage[J].CellMolLifeSci, 2002,59(1):5-18.

[11] Shirazi-Adl A, Taheri M, Urban J P. Analysis of cell viability in intervertebral disc: effect of endplate permeability on cell population[J].JBiomech, 2010,43(7):1330-6.

[12] Lee J M, Song J Y, Baek M, et al. Interleukin-1β induces angiogenesis and innervation in human intervertebral disc degeneration[J].JOrthopRes, 2011,29(2):265-9.