萬(wàn) 陽(yáng)，敖 英,3，李 斌，熊 穎，孫朝霞，胡霜霜，汪 暉,3

(武漢大學(xué) 1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系、2. 中南醫(yī)院骨科、3. 發(fā)育源性疾病湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430071)

流行病學(xué)資料顯示，多種腎臟疾病(如高血壓、慢性腎病等)均存在著宮內(nèi)發(fā)育起源，不良宮內(nèi)環(huán)境可致子代成年后相關(guān)疾病的易感性增加[1]。大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究也證實(shí)，宮內(nèi)發(fā)育遲緩(intrauterine growth retardation, IUGR)可致胚胎腎臟發(fā)育不良，腎單位數(shù)量低于正常，出生后腎小球代償性肥大和超濾過，并進(jìn)一步導(dǎo)致腎小球硬化，出現(xiàn)高血壓和腎損害的臨床表現(xiàn)[2]?？梢姡ツI發(fā)育不良是多種胎源性腎病的共同病理生理學(xué)基礎(chǔ)。

IUGR的發(fā)生除了先天遺傳因素外，很大程度上是因?yàn)樵兄?、晚期宮內(nèi)環(huán)境欠佳所致，其中，孕期母體攝入咖啡因是確切的誘因之一。咖啡因存在于多種軟飲料(如咖啡、可樂)中，并倍受人們喜愛，我國(guó)咖啡因的消耗量也在逐年增加。流行病學(xué)研究表明，孕婦每天咖啡因攝入量大于150 mg(2.5 mg·kg-1)就會(huì)導(dǎo)致IUGR，且攝入咖啡因的孕婦，其流產(chǎn)率可提高1倍多[3]。本課題組前期研究也證實(shí)，孕期咖啡因暴露(prenatal caffeine exposure, PCE)可導(dǎo)致胎鼠IUGR發(fā)生[4]。然而，PCE所致宮內(nèi)胎腎發(fā)育不良的機(jī)制尚不明確。本研究首先在本室前期穩(wěn)定建立的PCE所致大鼠IUGR模型上證實(shí)PCE胎鼠存在腎臟發(fā)育不良，進(jìn)一步在細(xì)胞水平通過觀察皮質(zhì)酮(corticosterone, CORT)對(duì)后腎間充質(zhì)細(xì)胞發(fā)育的影響以探究其發(fā)生機(jī)制，以期為證實(shí)孕期不良環(huán)境所致IUGR子代腎臟疾病易感性增加提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器咖啡因(分析純級(jí)別)購(gòu)自美國(guó) Sigma公司；乙醚購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；大鼠CORT的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購(gòu)于美國(guó)R&D公司；A型膠原酶由瑞士Roche公司生產(chǎn)；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶均由美國(guó)Gibco公司生產(chǎn)；引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成；逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒由大連TaKaRa公司提供。ND2000C紫外分光光度計(jì)和低溫高速離心機(jī)均購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；顯微鏡購(gòu)于日本Nikon公司；實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)于美國(guó)Applied Biosystems公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞處理SPF級(jí)健康♂[體質(zhì)量(280±20)g]及♀[體質(zhì)量(200±20)g]Wistar大鼠，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2009-2011。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每晚6時(shí)按♀ ∶♂=2 ∶1合籠，次晨觀察雌鼠陰栓或陰道涂片鏡檢，查到陰栓或精子之日為受孕0 d(gestation day, GD0)。每日上午9時(shí)檢查孕鼠生仔情況，若生仔記為生后d 0(PD0)。GD9-GD20每天經(jīng)口灌胃給予不同劑量咖啡因(30、120 mg·kg-1)，對(duì)照組灌胃給予等容量蒸餾水，直至自然生產(chǎn)。在GD20，采用乙醚吸入的方式全身麻醉部分孕鼠，待翻正反射消失后迅速處死。將子代胎崽數(shù)為8～14個(gè)且♂♀比接近1的孕鼠納入最終研究，收集它們各自的♀胎鼠。IUGR診斷依據(jù)為胎鼠體質(zhì)量低于對(duì)照組胎鼠體質(zhì)量平均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，IUGR率的計(jì)算是依據(jù)每窩IUGR胎鼠數(shù)比上該窩的總胎崽數(shù)。隨機(jī)選擇每一窩的♀胎鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究，收集大動(dòng)脈血液，在4°C高速離心機(jī)下17 205×g離心15 min，留取上清液儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱，以測(cè)血CORT濃度，隨機(jī)選取部分左側(cè)胎腎固定于體積分?jǐn)?shù)為0.04的中性甲醛固定液，待做形態(tài)學(xué)分析。右側(cè)胎腎迅速用液氮冷凍，并儲(chǔ)存于-80℃冰箱待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)分析。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：參照文獻(xiàn)分離GD13.5原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞[5]，選擇SPF級(jí)健康的孕13 d ♀ Wistar大鼠，由湖北省疾病預(yù)防控制中心提供，許可證號(hào)：SCXK(鄂)2015-0018。乙醚麻醉處死孕鼠，并經(jīng)過體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇溶液進(jìn)行滅菌，用無(wú)菌手術(shù)器械取出胚胎，并進(jìn)入超凈工作臺(tái)中取出胎腎，置入加有PBS的培養(yǎng)皿中進(jìn)行多次漂洗，用眼科剪剪碎胎腎，用0.2%的A型膠原酶消化約15 min得到原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞的懸液，經(jīng)過細(xì)胞篩過濾后，離心機(jī)1 000×g離心5 min，洗滌細(xì)胞并去掉上清，得到原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞，按1×108·L-1的濃度接種在6孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，給予含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)，并給予不同濃度CORT(250、500、1 000 μg·L-1)處理，24 h后收取細(xì)胞，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)相關(guān)基因的表達(dá)變化。

1.3血清CORT濃度的測(cè)定按照ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清CORT濃度，其中試劑盒可檢測(cè)到的最低CORT濃度為0.39 μg·L-1，其批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為5.0%和7.2%。

1.4病理學(xué)檢查胎鼠實(shí)驗(yàn)中，每組隨機(jī)選取3只胎鼠，取左側(cè)腎臟，沿長(zhǎng)軸縱向剖開，體積分?jǐn)?shù)為0.04的中性甲醛固定液固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變。對(duì)于每張切片，選取腎門正對(duì)區(qū)域，400倍光鏡下拍照。

1.5實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)按照 RNA-Solv Reagent使用說(shuō)明書提取胎腎和細(xì)胞總RNA。測(cè)定A260和A280，計(jì)算RNA的濃度及純度，調(diào)整RNA濃度至1 g·L-1。cDNA合成和PCR擴(kuò)增均按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。檢測(cè)胎腎和細(xì)胞腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)組分中血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(angiotensin converting enzyme，ACE)、血管緊張素Ⅱ1型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 1, AT1R)、血管緊張素Ⅱ2型受體(angiotensin Ⅱ receptor type 2, AT2R)、膠質(zhì)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(glial-cell-line-derived neurotrophic factor, GDNF)/c-Ret 受體酪氨酸激酶(c-Ret tyrosine kinase receptor，c-Ret)通路、配對(duì)盒基因(paired box gene 2，Pax2)、Spry1以及內(nèi)參基因GAPDH的mRNA表達(dá)。各指標(biāo)引物及擴(kuò)增條件見Tab 1。擴(kuò)增產(chǎn)物回收按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。將回收產(chǎn)物以10倍梯度稀釋成一系列濃度，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取至少5個(gè)梯度濃度為標(biāo)準(zhǔn)品，與樣品一起在實(shí)時(shí)定量PCR儀(RG-3000 Rotor-Gene)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增；以標(biāo)準(zhǔn)品的相對(duì)濃度為橫坐標(biāo)，測(cè)得各自的Ct值為縱坐標(biāo)作圖，即得標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品Ct值在各自標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到樣品的相對(duì)濃度，以GAPDH作為內(nèi)對(duì)照，計(jì)算各指標(biāo)與GAPDH濃度比作為其mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。每個(gè)樣品針對(duì)GAPDH mRNA含量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

Tab 1 Oligonucleotide primers and PCR conditions of rat in quantitative real-time PCR

2 結(jié)果

2.1PCE對(duì)胎鼠腎臟形態(tài)與功能發(fā)育的影響首先，我們觀察了宮內(nèi)時(shí)期GD20 ♀胎鼠的腎臟發(fā)育。如Fig 1A所示，HE染色400倍光鏡下可見，對(duì)照組胎腎生腎區(qū)腎小球結(jié)構(gòu)正常，而PCE(120 mg·kg-1)組胎腎腎小球球囊空虛，鮑曼囊腔變大，腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)發(fā)育不良。Fig 1B-1E的qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCE(30、120 mg·kg-1)組胎腎發(fā)育基因Pax2、GDNF、c-Ret、PI3K的mRNA表達(dá)均呈劑量依賴性降低(P<0.05，P<0.01)。提示PCE可導(dǎo)致胎腎發(fā)育不良，與胎腎GDNF/c-Ret 信號(hào)通路低表達(dá)有關(guān)。

2.2PCE對(duì)胎鼠血CORT濃度和腎臟局部RAS組分的影響為了探討血CORT和腎臟組織RAS是否參與PCE所致的胎腎發(fā)育不良，我們檢測(cè)了胎血CORT濃度、胎腎局部RAS組分(ACE、AT1R、AT2R)的表達(dá)。如Fig 2A所示，與對(duì)照組相比，PCE(30 mg·kg-1)組的胎血CORT濃度無(wú)明顯變化，而PCE(120 mg·kg-1)組升高(P<0.05)。Fig 2B～2D的qPCR結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，PCE(30、120 mg·kg-1)組胎腎ACE、AT1R、AT2R的mRNA表達(dá)均呈劑量依賴性降低(P<0.05,P<0.01)。提示PCE可升高胎血CORT含量，并使胎腎AT1R、AT2R的表達(dá)抑制。

2.3皮質(zhì)酮對(duì)原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞GDNF/c-Ret信號(hào)通路的影響為了探究PCE所致胎腎發(fā)育不良的具體機(jī)制，我們?cè)诩?xì)胞水平觀察了CORT對(duì)原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)影響。基于Fig 2A中的血清CORT濃度，我們細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中選擇的濃度分別為250、500、1 000 μg·L-1。如Fig 3所示，與對(duì)照組相比， CORT(250、500、1 000 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h，GDNF/c-Ret信號(hào)通路Pax2、GDNF、c-Ret表達(dá)呈不同程度的降低 (P<0.05，P<0.01)。而與對(duì)照組相比，CORT(250、500、1 000 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h，GDNF/c-Ret信號(hào)通路抑制基因Spry1的表達(dá)呈不同程度的升高(P<0.01)。提示CORT可使原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞的GDNF/c-Ret信號(hào)通路的表達(dá)抑制。

Fig 1 Effects of prenatal caffeine exposure (PCE) onfetal kidney development and GDNF/c-Ret pathway-related genes in female fetal rats(±s, n=5～7)

A: Kidney sections were stained with HE (×400); B: Pax2 mRNA expression; C: GDNF mRNA expression; D: c-Ret mRNA expression; E: PI3K mRNA expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 2 Effects of PCE on serum corticosterone (CORT) concentration andrenal renin-angiotensin system-related genes in female fetal rats(±s, n=5～8)

A: Serum CORT concentration; B: ACE mRNA expression; C: AT1R mRNA expression; D: AT2R mRNA expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.4皮質(zhì)酮對(duì)原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞RAS組分的影響我們進(jìn)一步檢測(cè)CORT對(duì)原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞RAS組分的影響。如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，CORT(250、500、1 000 μg·L-1)處理細(xì)胞24 h后，RAS組分(ACE、AT1R、AT2R)表達(dá)呈不同程度的降低 (P<0.05,P<0.01)。提示CORT可使原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞的AT1R、AT2R的表達(dá)抑制。

3 討論

本室前期研究發(fā)現(xiàn)，孕期尼古丁暴露可導(dǎo)致IUGR胎鼠腎臟發(fā)育不良，且成年后腎小球硬化的易感性增加[6]。因此，為了研究PCE所致IUGR仔鼠胎腎發(fā)育不良的機(jī)制，我們首先觀察了胎腎發(fā)育的變化。病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)，PCE(120 mg·kg-1)組胎腎腎小球囊腔間隙加大，腎小球毛細(xì)血管網(wǎng)發(fā)育不良。提示PCE可導(dǎo)致胎腎發(fā)育不良，這可能是成年后腎小球硬化的宮內(nèi)發(fā)育起源。

已知GDNF/c-Ret信號(hào)通路是后腎發(fā)育的主要誘導(dǎo)者。后腎間充質(zhì)細(xì)胞分泌GDNF，該因子與腎導(dǎo)管上皮細(xì)胞中表達(dá)的c-Ret酪氨酸激酶受體和GFRα1受體結(jié)合，激活PI3K/Akt、MAPK、PLCγ等下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)輸尿管芽的分支[7]。同時(shí)，GDNF/ c-Ret信號(hào)通路還受到多種上游信號(hào)分子的調(diào)節(jié)，其中，Spry1能抑制該信號(hào)通路的活性，而Pax2能激活GDNF信號(hào)通路[8]。本研究中，PCE(30、120 mg·kg-1)組胎腎Pax2、GDNF、c-Ret、PI3K的mRNA表達(dá)水平均降低，提示PCE可抑制Pax2/GDNF/c-Ret/PI3K信號(hào)通路，可能是其抑制胎腎發(fā)育的機(jī)制之一。文獻(xiàn)證實(shí)，腎單位的減少與腎內(nèi)RAS組分表達(dá)的改變有關(guān)[9]。在胎兒發(fā)育過程中，RAS 的主要活性物質(zhì)Ang Ⅱ能在腎臟局部表達(dá)[10]。其生理作用的發(fā)揮主要是通過其受體實(shí)現(xiàn)的，Ang II與AT1R結(jié)合后，可活化EGF、RTK、c-Ret 等RTK蛋白，繼而激活GDNF/c-Ret通路下游PI3K通路；而與AT2R的結(jié)合可促進(jìn)GDNF/c-Ret通路上游基因Pax2的表達(dá)，從而激活GDNF/c-Ret通路[11]。可見，AT1R和AT2R對(duì)胎腎發(fā)育均有促進(jìn)作用，但作用環(huán)節(jié)不同。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)PCE(30、120 mg·kg-1)組♀胎腎AT1R和AT2R的mRNA表達(dá)水平降低。這些結(jié)果提示，PCE可能通過抑制♀胎鼠腎臟局部ATRs及GDNF/c-Ret信號(hào)通路相關(guān)基因的表達(dá)，從而抑制腎單位的發(fā)育，造成胎腎發(fā)育不良。

Fig 3 Effects of CORT on GDNF/c-Ret pathway-related genes in metanephric mesenchyme stem cells(±s, n=5)

A: Pax2 mRNA expression; B: GDNF mRNA expression; C: c-Ret mRNA expression; D: Spry1 mRNA expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 4 Effects of CORT on renin-angiotensin system-related genes in metanephric mesenchyme stem cells(±s, n=5)

A: ACE mRNA expression; B: AT1R mRNA expression; C: AT2R mRNA expression.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，PCE可引起子代IUGR及多臟器發(fā)育不良，其發(fā)生與PCE所致胎盤糖皮質(zhì)激素(glucocorticoid, GC)屏障開放，導(dǎo)致母源性GC過暴露有關(guān)[12]。文獻(xiàn)報(bào)道，宮內(nèi)時(shí)期高GC水平是胎兒疾病編程的主要始動(dòng)因素，高GC通過調(diào)控胎兒一系列神經(jīng)內(nèi)分泌代謝過程，引起胚胎組織結(jié)構(gòu)和功能的持續(xù)性改變[13-14]。本研究中，PCE(120 mg·kg-1)組♀胎鼠血CORT濃度也明顯升高；另有研究則認(rèn)為，GC過暴露可以負(fù)向調(diào)節(jié)胎兒腎內(nèi)RAS組分的表達(dá)[15]。提示PCE胎鼠腎臟局部ATR的低表達(dá)可能與宮內(nèi)高CORT有關(guān)。因此，為了探究其具體機(jī)制，我們進(jìn)一步使用外源性CORT處理原代后腎間充質(zhì)細(xì)胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同濃度外源性CORT處理可使后腎間充質(zhì)細(xì)胞AT1R、AT2R、Pax2、GDNF、c-Ret的mRNA表達(dá)水平均降低，而Spry1表達(dá)則有不同程度升高。綜合上述，我們證實(shí)，高CORT可通過抑制腎臟組織中AT1R/AT2R及GDNF/c-Ret信號(hào)通路的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致胎腎發(fā)育不良。

綜上，我們?cè)谧C實(shí)PCE所致胎腎發(fā)育不良的基礎(chǔ)上，提出了高血CORT可能介導(dǎo)PCE所致♀子代胎腎發(fā)育不良的機(jī)制。我們認(rèn)為，PCE所致高血CORT可抑制胎腎AT1R/AT2R及GDNF/c-Ret信號(hào)通路的表達(dá)，導(dǎo)致胎腎發(fā)育不良。本研究結(jié)果為了解PCE的腎臟發(fā)育毒性并闡明其毒性機(jī)制，提供了實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)主要在武漢大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系汪暉實(shí)驗(yàn)室完成，感謝李寧、鐘衛(wèi)華飼養(yǎng)動(dòng)物。)

[1] Boubred F, Saint-Faust M, Buffat C, et al. Developmental origins of chronic renal disease: an integrative hypothesis[J].IntJNephrol, 2013,2013: 346067.

[2] Brenner B M, Garcia D L, Anderson S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more the other[J]?AmJHyperten, 1988,1(4 Pt 1): 335-47.

[3] Fernandes O, Sabharwal M, Smiley T, et al. Moderate to heavy caffeine consumption during pregnancy and relationship to spontaneous abortion and abnormal fetal growth: a meta-analysis[J].ReprodToxicol, 1998,12(4): 435-44.

[4] Xu D, Wu Y, Liu F, et al. A hypothalamic-pituitary-adrenal axis-associated neuroendocrine metabolic programmed alteration in offspring rats of IUGR induced by prenatal caffeine ingestion[J].ToxicolApplPharmacol, 2012,264(3): 395-403.

[5] Tanigawa S, Sharma N, Hall M D, et al. Preferential propagation of competent SIX2+ nephronic progenitors by LIF/ROCKi treatment of the metanephric mesenchyme[J].StemCellRep, 2015,5(3): 435-47.

[6] Sun Z X, Hu S S, Zuo N, et al. Prenatal nicotine exposure induced GDNF/c-Ret pathway repression-related fetal renal dysplasia and adult glomerulosclerosis in male offspring[J].ToxicolRes, 2015,4:1045-58.

[7] Song R, Spera M, Garrett C, et al. Angiotensin II-induced activation of c-Ret signaling is critical in ureteric bud branching morphogenesis[J].MechDev, 2010,127(1): 21-7.

[8] Clarke J C, Patel S R, Raymond R M Jr, et al. Regulation of c-Ret in the developing kidney is responsive to Pax2 gene dosage[J].HumMolGenet, 2006,15(23): 3420-8.

[9] Gilbert J S, Nijland M J. Sex differences in the developmental origins of hypertension and cardiorenal disease[J].AmJPhysiolRegulIntegrCompPhysiol, 2008,295(6): R1941-52.

[10] 高 峰, 張 濤, 王曉梅，等. 血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2015,31(2):247-50.

[10] Gao F, Zhang T, Wang X M, et al. Effect of angiotensin Ⅱ on expression of Notch pathway and Nephrin in podocyte [J].ChinPharmacolBull, 2015,31(2): 247-50.

[11] Yosypiv I V. Renin-angiotensin system in ureteric bud branching morphogenesis: implications for kidney disease[J].PediatrNephrol, 2014,29(4): 609-20.

[12] Xu D, Zhang B, Liang G, et al. Caffeine-induced activated glucocorticoid metabolism in the hippocampus causes hypothalamic-pituitary-adrenal axis inhibition in fetal rats[J].PLoSOne, 2012,7(9): e44497.

[13] Moisiadis V G, Matthews S G. Glucocorticoids and fetal programming part 1: outcomes[J].NatRevEndocrinol, 2014,10(7): 391-402.

[14] Moisiadis V G, Matthews S G. Glucocorticoids and fetal programming part 2: mechanisms[J].NatRevEndocrinol, 2014,10(7): 403-11.

[15] Zandi-Nejad K, Luyckx V A, Brenner B M. Adult hypertension and kidney disease: the role of fetal programming[J].Hypertension, 2006,47(3): 502-8.