王 青，宋麗娟，尉杰忠，楊智超，姜維佳，李艷花，郭文娟，馬存根,

(1. 山西中醫(yī)藥大學國家中醫(yī)藥管理局益氣活血重點研究室, 山西 太原 030024；2. 山西大同大學腦科學研究所，山西 大同 037009)

小膠質(zhì)細胞(microglia, MG)分布于整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)，屬于單核吞噬細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最主要的免疫防線。正常情況下，激活的MG不停地清除有毒物質(zhì)、損壞的神經(jīng)、折疊錯誤的蛋白等[1]。在病理情況下，MG持續(xù)激活，釋放大量細胞毒性因子，且細胞表面膜受體密度急劇增加，如甲酰肽受體-2(formyl peptide receptor-2, FPR2)、糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation endproducts, RAGE)、CD36等[2-3]。這些受體在周圍刺激因子的作用下，引起炎癥的級聯(lián)反應，促進了神經(jīng)炎癥的循環(huán)惡化，加重正常神經(jīng)組織和細胞損傷。

FPR屬于趨化受體家族，主要有FPR1、FPR2、FPR3 3種亞型，是7次跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，可以介導免疫調(diào)節(jié)、炎癥因子分泌、細胞趨化和細胞黏附，與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FPR2含有351個氨基酸殘基，與FPR1和FPR3的同源性高達69%和83%[4]。FPR1和FPR2是研究最為廣泛的受體，它們主要分布于肥大細胞、粒細胞、單核巨噬細胞、淋巴細胞等免疫細胞，此外還表達于肺上皮細胞、肝細胞、腎細胞、血管內(nèi)皮細胞和星形膠質(zhì)細胞[5]。因此，F(xiàn)PR1和FPR2與很多疾病密切相關(guān)，包括細菌和病毒感染、炎癥、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病和代謝性相關(guān)疾病等，使得它們成為治療多種疾病潛在的靶點。但FPR1和FPR2與MG介導的炎癥之間的關(guān)系并不清楚，因此，本研究用脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)誘導的MG系BV-2細胞為炎癥模型，初步探討其在LPS誘導的中樞神經(jīng)炎癥中的作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 小膠質(zhì)細胞系BV-2細胞，購自武漢大學細胞庫。

1.1.2試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco公司)；LPS、甲酰化肽(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalainie, fMLF)、Boc-2細胞裂解液，均購自Sigma公司；Leu-Glu-Ser-Ile-Phe-Arg-Ser-Leu-Leu-Phe-Arg-Val-Met(MMK-1)(Tocris Bioscience公司)；DAPI(碧云天生物技術(shù)公司)；ECL(Thermo公司)；小鼠β-actin抗體、小鼠NF-κB抗體、小鼠磷酸化NF-κB抗體(Bioworld公司)；小鼠FPR2抗體(Santa Cruz公司)；小鼠FPR1抗體(Abcam公司)；白介素1β(interleukin-1β, IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α, TNF-α) ELISA試劑盒(R&D公司)；辣根過氧化酶標記的羊抗兔二抗(康為世紀)。

1.1.3儀器 CO2培養(yǎng)箱 (Thermo)，全波長酶標儀 (Molecular Devices)，小型垂直電泳槽 、小型濕法轉(zhuǎn)膜儀、基礎(chǔ)通用電源(Bio-Rad)。

1.2方法

1.2.1Western blot實驗 BV-2細胞接種于60 mm培養(yǎng)皿，用1 mg·L-1的LPS孵育12 h后，收集細胞，用lysis裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。蛋白上樣量為30 μg，10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕法轉(zhuǎn)膜(200 mA, 2 h)，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗3次，室溫孵育二抗2 h，ECL法檢測。

1.2.2Transwell趨化實驗 取對數(shù)生長期的BV-2細胞懸液，接種于100 mm培養(yǎng)皿，LPS作用12 h后，細胞用無血清的高糖DMEM重懸，將細胞數(shù)調(diào)整為5×108·L-1。① 考察FPR2在BV-2細胞趨化中的作用。分別取上述200 μL細胞置于Transwell小室上室。下室分別以高糖DMEM、fMLF(2、5、10、20、50、100 nmol·L-1)和MMK-1(2、5、10、20、50 nmol·L-1)為趨化劑。② 驗證FPR2介導的細胞趨化可被其特異性的拮抗劑Boc-2阻斷。上述細胞分為Boc-2+MMK-1組和MMK-1組。Boc-2+MMK-1組：預先用含10 μmol·L-1的Boc-2培養(yǎng)液孵育30 min，PBS洗3遍后，無血清的高糖DMEM重懸，細胞數(shù)調(diào)整為5×108·L-1，取200 μL細胞置于Transwell小室上室。MMK-1組：預先用無血清的高糖DMEM孵育細胞30 min，PBS洗3遍后，無血清的高糖DMEM重懸，細胞數(shù)調(diào)整為5×108·L-1，取200 μL細胞置于Transwell小室上室。在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，去除培養(yǎng)液，用PBS洗3次，甲醇固定10 min，5 mg·L-1的DAPI室溫孵育20 min后，PBS洗3次，熒光顯微鏡下觀察拍照。實驗結(jié)果用趨化指數(shù)表示，趨化指數(shù)為給藥組與空白組的比值[6]。

1.2.3ELISA法檢測IL-1β和TNF-α水平 取對數(shù)生長期的BV-2細胞懸液，調(diào)整細胞密度為5×108·L-1，接種于96孔細胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，培養(yǎng)24 h后，加入1 mg·L-1的LPS孵育12 h，建立體外細胞炎癥模型。① 檢測FPR2對BV-2細胞炎性因子分泌的影響。上述細胞分別加入完全培養(yǎng)液，fMLF(20 nmol·L-1)和MMK-1(20 nmol·L-1)，每組6個復孔。② 考察FPR2介導的細胞炎性因子可被其特異性的拮抗劑Boc-2阻斷。上述細胞分為Boc-2+MMK-1組和MMK-1組。Boc-2+MMK-1組：預先用10 μmol·L-1的Boc-2培養(yǎng)液孵育細胞30 min，PBS洗3遍后，加入20 nmol·L-1的MMK-1，6個復孔；MMK-1組：預先用完全培養(yǎng)液孵育細胞30 min，PBS洗3遍后，加入20 nmol·L-1的MMK-1，6個復孔。在CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用ELISA法檢測TNF-α和IL-1β的分泌情況。

2 結(jié)果

2.1LPS對BV-2細胞表面FPR2表達的影響LPS孵育BV-2細胞12 h后發(fā)現(xiàn)FPR1蛋白沒有明顯變化，而FPR2表達明顯上調(diào)(Fig 1)，表明LPS可誘導BV-2細胞FPR2表達增加，而不是FPR1。

Fig1LevelsofFPR1andFPR2inLPS-induced-BV-2cells

A: LPS up-regulated expression of FPR2; B: The relative grey value of FPR1 and FPR2 protein.**P<0.01vscontrol

2.2fMLF和MMK-1對LPS-BV-2細胞趨化行為的影響fMLF和MMK-1分別是FPR1和FPR2特異性激動劑，本研究考察了不同濃度的fMLF和MMK-1對LPS-BV-2細胞的趨化作用。Fig 2結(jié)果表明，20 nmol·L-1的MMK-1可明顯誘導LPS-BV-2細胞趨化，而fMLF卻沒有此效應。說明FPR2參與了LPS誘導的炎癥反應。

2.3fMLF和MMK-1對BV-2細胞炎癥因子釋放的影響為了驗證FPR2的作用，本研究檢測了fMLF和MMK-1對LPS-BV-2細胞炎癥因子釋放的影響。Fig 3結(jié)果表明，與LPS組相比，MMK-1可以進一步促進IL-1β和TNF-α的分泌。

2.4拮抗劑對BV-2炎癥因子釋放和趨化行為的影響為了進一步驗證FPR2對炎癥的促進作用，我們考察了FPR2的拮抗劑Boc-2對MMK-1效應的作用，發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1的Boc-2可以抑制MMK-1誘導的細胞趨化和炎癥因子的釋放(Fig 4)。

Fig 2 Chemotaxis of LPS-BV-2 cells induced by fMLF and MMK-1

The chemotaxis of LPS-BV-2 cells induced by different doses of MMK-1(A) and fMLF(C); B, D: The quantitative analysis of cell migration induced by MMK-1 and fMLF.*P<0.05vsLPS.

Fig 3 Effect of fMLF and MMK-1 on LPS-BV-2-cells

A: Enhancement of IL-1β induced by fMLF and MMK-1; B: Enhancement of TNF-α induced by fMLF and MMK-1.*P<0.05vsLPS.

2.5拮抗劑對NF-κB磷酸化的影響NF-κB是一類重要的核轉(zhuǎn)錄因子，與細胞遷移、炎癥因子分泌等密切相關(guān)[8]，因此，我們考察了MMK-1和抑制劑Boc-2對NF-κB的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Boc-2可以抑制MMK-1引起的NF-κB的磷酸化(Fig 5)，表明NF-κB參與了FPR2介導的細胞行為。

Fig 4 Effect of Boc-2 on MMK-1-induced LPS-BV-2-cells

A: The inhibitory effect of 10 μmol·L-1Boc-2 on chemotaxis of cells induced by MMK-1; B: The quantitative analysis of cell migration inhibited by Boc-2; C, D: The inhibitory effect of 10 μmol·L-1Boc-2 on secretion of IL-1β and TNF-α.**P<0.01vsMMK-1.

Fig 5 The inhibitory effect of 10 μmol·L-1Boc-2 on p-NF-κB of LPS-BV-2 cells induced by MMK-1

*P<0.05vsMMK-1

3 討論

近年來，MG介導的神經(jīng)炎癥在神經(jīng)退行性疾病中的重要作用，使其成為研究熱點，專家學者們都致力于闡明何種因子在其中為關(guān)鍵因素，進而找到有效的治療靶點。由于FPR家族在炎癥中的重要作用，使其不可避免地牽涉到神經(jīng)炎癥中。而且，F(xiàn)PR2能介導Aβ42引起的炎癥反應，在阿爾茨海默病腦部炎癥中起重要作用[4]。但異常活化的MG中FPR2是否參與炎癥的持續(xù)惡化，并不清楚。在此基礎(chǔ)之上，本文研究了LPS激活的BV-2細胞炎性反應中FPR1和FPR2的作用，發(fā)現(xiàn)LPS-BV-2細胞中FPR1表達沒有變化，而FPR2蛋白表達上調(diào)，說明LPS刺激MG引發(fā)的神經(jīng)炎癥沒有FPR1的參與，但可能與FPR2相關(guān)。

FPR2重要的激動劑有20多種，分別有病原微生物、內(nèi)源性肽類或脂類和肽庫或化合物來源，由于其基因的多態(tài)性，與不同的配體結(jié)合會產(chǎn)生不同的生理效應[9]。MMK-1是肽庫中篩選得到的激動劑，可通過FPR2趨化細胞、引起鈣動員、激活NADPH氧化酶和炎癥因子的分泌[10-11]。fMLF主要激動FPR1，可募集免疫細胞，促進黏附和炎癥反應[12]。Boc-FLFLFL(Boc-2)是FPR2的拮抗劑，能消除其激動劑脂氧素A4引起的細胞生物學效應[13]。為了驗證FPR2的重要作用，我們檢測了FPR1的激動劑fMLF、FPR2的激動劑MMK-1和拮抗劑Boc-2對LPS-BV-2細胞功能的影響，發(fā)現(xiàn)MMK-1可促進細胞遷移、增加IL-1β和TNF-α分泌、引起NF-κB磷酸化，這些效應均可被Boc-2拮抗。另外，fMLF對LPS-BV-2細胞功能并沒有明顯影響。確證了FPR2被活化后，可激活相關(guān)的信號通路，募集炎癥細胞，釋放炎癥因子，從而放大中樞神經(jīng)炎癥，促進疾病的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究初步發(fā)現(xiàn)，LPS刺激BV-2細胞可以上調(diào)FPR2蛋白表達，且FPR2參與了之后的炎癥級聯(lián)反應，為神經(jīng)炎癥的緩解和治療提供了新靶點。但其在神經(jīng)炎癥中的權(quán)重尚不清楚，這將是我們下一步研究的重點內(nèi)容。

(致謝：本研究是在國家中醫(yī)藥管理局多發(fā)性硬化益氣活血重點研究室完成的，感謝研究室各位老師的無私幫助。)

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