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(浙江理工大學(xué)材料與紡織學(xué)院，杭州 310018)

0 引 言

近年來癌癥的發(fā)病率和死亡率越來越高，抗癌藥物能有效殺死癌細(xì)胞,但藥物在血液環(huán)境中易被降解而無法在人體內(nèi)穩(wěn)定存在，為維持藥物在體內(nèi)的有效血藥濃度，研究者們設(shè)計(jì)了將藥物包覆在載體之上的載藥體系[1-2]。當(dāng)載體包覆藥物后，藥物能穩(wěn)定存在于血液環(huán)境中，從而達(dá)到增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性的效果。此外，載體還能在一定刺激條件下，對藥物進(jìn)行可控釋放，因此研究一種抗癌藥物的高效載體非常重要。

藥物載體材料的類型主要有無機(jī)材料[3-4]和有機(jī)高分子材料[5-6]，但無機(jī)材料在體內(nèi)釋放藥物后難降解，絲蛋白質(zhì)作為一種天然高分子材料，生物相容性良好，能被蛋白酶水解[7]，可作為藥物載體材料來解決在體內(nèi)降解困難的問題。同時，絲蛋白制備的纖維和膜具有一定的機(jī)械強(qiáng)度，應(yīng)用在手術(shù)縫紉線、人造血管及醫(yī)用敷料[8-11]等研究方面。Kundu等[12]采用去溶劑化的方法制備絲素納米顆粒，結(jié)果顯示絲素納米球呈β-折疊結(jié)構(gòu)，且無明顯細(xì)胞毒性。Wenk等[13]人以水楊酸為藥物模型，制得絲素蛋白載藥微囊，發(fā)現(xiàn)由濃度高的絲素蛋白溶液制備的載藥微囊，對藥物的釋放速率更穩(wěn)定。

本實(shí)驗(yàn)以絲蛋白為載體材料，阿霉素為抗腫瘤藥物模型，制備粒徑可控的微納米顆粒。在顆粒形成過程中，絲素顆粒將藥物阿霉素包覆在其中，從而實(shí)現(xiàn)對藥物阿霉素的負(fù)載；并在不同pH的磷酸鹽緩沖溶液(PBS)中，測定阿霉素的釋放速率和累積釋放量，對載藥微球響應(yīng)釋放阿霉素的性能進(jìn)行表征。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

蠶繭購自湖州新天絲生物技術(shù)有限公司，溴化鋰、碳酸鈉購自阿拉丁試劑(上海)有限公司，無水磷酸氫二鈉和無水磷酸二氫鈉購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，阿霉素購自上海士鋒生物科技有限公司。

1.2 絲素溶液的制備

將蠶繭加入0.02 mol/L的碳酸鈉溶液中煮沸30 min，重復(fù)兩次，用超純水洗滌3次，于60 ℃烘箱中干燥過夜。稱取15 mg脫膠后的絲素纖維，溶解在100 mL濃度為9.30 mol/L的溴化鋰溶液中，60 ℃反應(yīng)2 h。將溶解得到的絲素溶液置于透析袋中，去離子水透析3 d，每12 h更換去離子水，對所得溶液進(jìn)行離心即得到絲素溶液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 絲素微納米顆粒的制備及藥物負(fù)載

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8、濃度為1.25 mol/L的磷酸鹽溶液，將濃度分別為0.50、1.00、1.50、2.00 mg/mL的絲素溶液緩慢滴加到磷酸鹽溶液中，低溫處理4 h后再在20 ℃熟化溫度下處理12 h，離心去離子水洗滌三次，得多孔的絲素微納米顆粒(silk fibroin nanoparticle,SFNPs)。選擇最優(yōu)的絲素溶液濃度作為下一步研究的工藝條件。

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8濃度分別為1.00、1.25、1.50、2.00 mol/L磷酸鹽溶液，將濃度為最優(yōu)的絲素溶液緩慢滴加到其中，低溫處理4 h后再在熟化溫度下處理12 h，離心洗滌三次，得到SFNPs。選擇最優(yōu)的磷酸鹽溶液濃度作為下一步研究的工藝條件。

用Na2HPO4和NaH2PO4配制pH值為8濃度為最優(yōu)濃度的磷酸鹽溶液，將濃度為最優(yōu)的絲素溶液緩慢滴加到其中，低溫處理4 h后再在不同熟化溫度(10、20、30、40 ℃)下處理12 h，離心洗滌三次，得到SFNPs。選擇最優(yōu)的熟化溫度作為下一步研究的工藝條件。

選取上述實(shí)驗(yàn)最優(yōu)工藝條件，將阿霉素加入到絲素溶液中，混合均勻后，將絲素溶液加入到磷酸鹽溶液中，低溫處理4 h后熟化溫度下處理12 h，離心洗滌，得到載藥絲素顆粒。

1.4 載藥顆粒對藥物的體外緩釋

將制備的載藥顆粒分散于pH為5.0、6.5、7.4的PBS中，放入37 ℃恒溫振蕩箱中，振蕩頻率150 r/min，分別隔1.0、2.5、4.5、7.0、10.5、14.0、19.0、25.0、32.0 h檢測阿霉素釋放量。

1.5 表征分析

采用場發(fā)射掃描電鏡(FE-SEM，日本Hitachi公司 S-4800型)觀察多孔絲素顆粒的表面形貌。

采用馬爾文激光粒度儀(Zetasizer，英國馬爾文儀器有限公司NanoZS90型)測定絲素顆粒的粒徑、粒徑分布及顆粒表面電位。

采用傅里葉紅外變換衰減全反射紅外吸收光譜儀(FTIR，美國Thermo Electron)對絲素蛋白在形成顆粒前后進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

采用紫外分光光度計(jì)測定阿霉素的在480 nm處的吸光度，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對絲素顆粒包覆藥物的載藥量和包封率[14]進(jìn)行定量計(jì)算。計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素濃度對SFNPs形貌及粒徑的影響

絲素溶液濃度會影響晶體生長，為了解絲素溶液濃度對SFNPs形貌及粒徑分布的影響，在SFNPs制備過程中保持熟化溫度為20 ℃，磷酸鹽溶液濃度為1.25 mol/L不變，僅改變絲素溶液濃度，分別為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。采用掃描電鏡和激光粒度儀對SFNPs的形貌和粒徑分布進(jìn)行表征，結(jié)果如圖1所示。圖1(a)中絲素濃度為0.5 mg/mL時，絲素顆粒表面為多孔結(jié)構(gòu)，圖1(e)中絲素顆粒的粒徑最小，主要分布在500～600 nm左右，顆粒為表面呈多孔結(jié)構(gòu)的球形。圖1(d)在絲素濃度增加到2.0 mg/mL時，絲素顆粒表面多孔結(jié)構(gòu)沒有變化，圖1(h)粒徑增大到1500 nm左右。從圖1的掃描電鏡照片看出隨著絲素溶液濃度增加，SFNPs的多孔結(jié)構(gòu)幾乎沒有發(fā)生變化，顆粒粒徑呈現(xiàn)增大的趨勢，激光粒度儀結(jié)果如圖1(e)-(h)，隨著絲素溶液濃度增加，絲素顆粒粒徑增加，也證實(shí)掃描電鏡觀察到的結(jié)果。其原因可能是在制備絲素顆粒的過程中，絲素溶液濃度越高，越易于析出，析出的絲素小顆粒作為晶種使溶液中的絲素蛋白能夠在其上生長，形成大的絲素顆粒[15]。圖1中絲素溶液濃度0.5 mg/mL和1.0 mg/mL相比，后者顆粒粒徑稍有增加，粒徑分布變化不大，考慮到產(chǎn)量的問題，這里選擇濃度為1.0 mg/mL。

2.2 熟化溫度對SFNPs形貌及粒徑的影響

溫度會影響晶體生長，為探究熟化溫度對絲素形貌及粒徑分布的影響，在絲素溶液濃度為1 mg/mL，磷酸鹽濃度為1.25 mol/L的工藝條件下，分別在不同熟化溫度下制備SFNPs，采用掃描電子顯微鏡及激光粒度儀對SFNPs進(jìn)行表征。圖2(a)中熟化溫度為10 ℃時，絲素顆粒主要呈球形，少部分為短棒狀，表面呈多孔結(jié)構(gòu)，圖2(e)粒徑主要分布在2000～2300 nm左右。圖2(d)當(dāng)熟化溫度升高到40 ℃時，跟圖2(a)相比，更多顆粒呈球形，表面多孔結(jié)構(gòu)沒有變化，且粒徑減小，減少到1500～1700 nm。從圖2的掃描電鏡圖中看出，絲素顆粒形貌變化不大，隨著熟化溫度的增加，絲素顆粒粒徑呈現(xiàn)減小的趨勢。激光粒度儀結(jié)果表明熟化溫度越高，絲素顆粒粒徑越小，而且粒徑分布范圍更窄。這是由于晶核在低溫條件下生長速度快，高溫會破壞已形成的有序晶核，特別是在均相成核中，因而隨著熟化溫度升高，絲素顆粒粒徑減小[16]?？紤]到粒徑小有利于細(xì)胞吞噬，因此選熟化溫度為40 ℃。

圖1 不同絲素溶液濃度的SFNPs掃描電鏡照片和的粒徑分布

圖2 不同熟化溫度的絲素顆粒掃描電鏡照片及其粒徑分布

2.3 離子強(qiáng)度對SFNPs形貌及粒徑的影響

蛋白質(zhì)是親水性大分子，在水溶液中有雙電層結(jié)構(gòu)，以保證分子的溶解度平衡并在水溶液中穩(wěn)定存在。當(dāng)加入無機(jī)鹽類時，鹽會電離成為離子態(tài)，鹽離子的電性破壞溶液中蛋白質(zhì)的雙電層結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀析出[17]。不同離子強(qiáng)度對蛋白質(zhì)雙電層的影響程度不同，為探究不同離子強(qiáng)度對絲素顆粒及粒徑分布，在絲素溶液濃度為1 mg/mL，熟化溫度為40 ℃工藝條件下，采用掃描電鏡和激光粒度儀對絲素顆粒形貌及粒徑分布進(jìn)行表征。圖3(a)離子強(qiáng)度為1.00 mol/L時，顆粒表面呈多孔結(jié)構(gòu)，圖3(e)粒徑主要分布在950 nm左右。當(dāng)離子強(qiáng)度增加到2.00 mol/L時，如圖3(d)所示，顆粒表面多孔結(jié)構(gòu)減少，圖3(h)粒徑主要集中在500 nm左右，且粒徑分布范圍更窄。圖3掃描電鏡結(jié)果顯示，隨著離子強(qiáng)度增加，絲素表面形貌更加趨向平滑，粒徑分布呈減小的趨勢，激光粒度儀結(jié)果如圖3(e)-(h)，隨著離子強(qiáng)度增加，絲素顆粒粒徑減小，也證實(shí)掃描電鏡中粒徑減小的現(xiàn)象。

為證實(shí)離子強(qiáng)度影響絲素蛋白的雙電層結(jié)構(gòu)，測定不同離子強(qiáng)度制得的絲素顆粒的表面電位。圖4結(jié)果表明，當(dāng)離子強(qiáng)度為1.00 mol/L時，顆粒表面電位為-35 mV，當(dāng)離子強(qiáng)度增加到2.00 mol/L時，顆粒表面電位增加-47 mV左右，這表明隨著離子強(qiáng)度的增加，絲素顆粒的表面電位也增加，這一結(jié)果跟前面圖3分析得到的隨著離子強(qiáng)度增加，顆粒粒徑減小的結(jié)果一致，即離子強(qiáng)度越高，對蛋白質(zhì)雙電層影響程度越大，高的表面電位有利于顆粒在溶液體系中穩(wěn)定存在，在制備藥物載體時選用離子強(qiáng)度為2.00 mol/L的鹽浴溶液。

圖3 不同離子強(qiáng)度的絲素顆粒掃描電鏡照片及粒徑分布

圖4 不同離子強(qiáng)度制得的絲素顆粒的Zeta電位

2.4 SF鹽析前后構(gòu)象的變化

將新制的絲素蛋白溶液通過冷凍干燥，得再生絲素蛋白(regenerated silk fibroin，RSF)，RSF、SFNPs的紅外光譜圖如圖5所示。再生絲素蛋白在形成微納米顆粒后，RSF的酰胺Ⅰ峰(C=O伸縮振動)的位置從原來的1633.22 cm-1移到了1655.14 cm-1[18]，表明絲素鹽析后的構(gòu)象趨向于形成無規(guī)線團(tuán)，說明高濃度的鹽溶液不利于了絲素纖維的有序排列。SFNPs在1540.86 cm-1處的酰胺Ⅱ(N-H彎曲振動)和1239.43 cm-1處的酰胺Ⅲ(C-N伸縮振動)峰值明顯增加，也說明絲素蛋白顆粒大部分為無規(guī)線團(tuán)結(jié)構(gòu)和少量α-螺旋結(jié)構(gòu)。

圖5 絲素蛋白鹽析前后紅外譜圖

2.5 SFNPs的藥物負(fù)載

將未載藥的純絲素顆粒、載藥的絲素顆粒及藥物阿霉素(DOX)，跟溴化鉀粉末研磨后進(jìn)行壓片，得到SFNPs、DOX、SFNPs-DOX的紅外光譜圖，結(jié)果如圖6所示。

由圖6結(jié)果可知，載藥后的絲素顆粒分別在2850.32、1281.90、989.03 cm-1呈現(xiàn)出阿霉素的特征振動峰，表明阿霉素已經(jīng)成功被絲素顆粒包覆在顆粒中。由于SFNPs呈很高的負(fù)電性，Zeta電位為-47 mV，阿霉素呈弱正電性，阿霉素通過靜電吸附的方式負(fù)載于絲素顆粒上，從而使SFNPs實(shí)現(xiàn)對藥物阿霉素的負(fù)載。

圖6 載藥絲素顆粒的紅外光譜圖

為實(shí)現(xiàn)載體對藥物阿霉素的負(fù)載量和包封率的定量計(jì)算，通過紫外分光光度計(jì)對溶液中未包覆的阿霉素進(jìn)行測定，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7所示，阿霉素的濃度與吸光度呈線性相關(guān)，方程式為Y=0.024X-0.001，曲線擬合度R2為0.99983，計(jì)算得載藥量為14.08 μg/mg，包封率為93.86%。表明SFNPs將絕大部分阿霉素負(fù)載在其上，實(shí)現(xiàn)對抗癌藥物阿霉素的高效負(fù)載。

圖7 阿霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.6 藥物的pH響應(yīng)釋放

由于癌細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的pH值呈弱酸性，pH為5.0的PBS模擬癌細(xì)胞中內(nèi)涵體和溶酶體的微環(huán)境，pH值為6.5的PBS模擬腫瘤細(xì)胞外環(huán)境，pH值為7.4的PBS模擬體內(nèi)血漿環(huán)境[19]。阿霉素是通過靜電吸附的方式負(fù)載于絲素顆粒中，不同pH條件會影響其靜電相互作用[20]，根據(jù)環(huán)境pH值的不同實(shí)現(xiàn)藥物的響應(yīng)釋放。

圖8為載藥絲素顆粒在不同pH值的PBS中的累積釋放藥物阿霉素的量隨時間的關(guān)系曲線。圖8結(jié)果表明，當(dāng)PBS的pH為7.4時，藥物釋放速率最慢，在釋放7 h后達(dá)平衡狀態(tài)，累積釋放量為25.85%。當(dāng)PBS的pH為6.5時，在釋放14 h后達(dá)到平衡，累積釋放量為41.21%。PBS的pH為5.0時藥物的釋放速率在最快，釋放14 h后達(dá)平衡期，藥物的總釋放量為68.21%。圖8說明酸性條件有利于藥物釋放。藥物在酸性條件下釋放量的增加，主要是由于酸性環(huán)境削弱了阿霉素和絲素蛋白之間的靜電作用，導(dǎo)致藥物從納米顆粒中釋放出來。以上結(jié)果表明絲素制得的納米顆?？勺鳛樗幬镙d體，并在弱酸性環(huán)境的腫瘤細(xì)胞內(nèi)部及周圍實(shí)現(xiàn)pH響應(yīng)釋放。

圖8 載藥絲素顆粒的體外釋放曲線

3 結(jié) 論

通過研究絲素溶液的濃度、熟化溫度、磷酸鹽溶液濃度，得到粒徑可控的多孔絲素顆粒。絲素溶液濃度越低，磷酸鹽溶液濃度越高，熟化溫度越高，制得的絲素顆粒粒徑越小。納米級多孔絲素顆粒對抗癌藥物阿霉素的負(fù)載性能良好，藥物釋放速率和累積釋放量隨pH降低而增加，根據(jù)癌細(xì)胞內(nèi)部環(huán)境的pH比正常細(xì)胞低，可實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，具有可觀的醫(yī)用前景，有望應(yīng)用于癌癥治療。

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