金 鑫,張 曼,王云鶴,魏 方,溫婧怡,付 勝,李易聰,楊銀鳳

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

1 細(xì)菌類益生菌誘導(dǎo)防御素的表達(dá)

1.1 乳酸桿菌與防御素表達(dá)的關(guān)系 近年來,關(guān)于乳酸桿菌誘導(dǎo)防御素的表達(dá)已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究。研究表明,乳酸桿菌與多種免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)相關(guān),并且能誘導(dǎo)抗炎因子和抗菌肽的產(chǎn)生。2003年王國興等[3]應(yīng)用RT-PCR法和Northern雜交檢測HT-29細(xì)胞 β-防御素-2(hBD-2)mRNA的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)在正常培養(yǎng)條件下HT-29細(xì)胞未見hBD-2 mRNA的表達(dá)信號,但在雙歧桿菌菌體、細(xì)胞壁和胞壁蛋白刺激后均檢測出顯著的hBD-2 mRNA表達(dá)。因此提示雙歧桿菌能誘導(dǎo)人腸腺上皮細(xì)胞hBD-2基因的表達(dá),且雙歧桿菌胞壁蛋白可能是起誘導(dǎo)作用的活性成分。

2008年 有學(xué)者選用不同的益生性乳酸桿菌刺激Caco-2細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)將Caco-2細(xì)胞與乳酸桿菌共同孵育6 h后,hBD-2 mRNA的表達(dá)量達(dá)到最大,并且隨著各種乳酸桿菌劑量的增大hBD-2 mRNA也增加,呈現(xiàn)劑量依賴性。隨后該學(xué)者為了闡明乳酸桿菌誘導(dǎo)hBD-2表達(dá)的機(jī)制,首先通過敲除hBD-2啟動(dòng)子上的核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)結(jié)合位點(diǎn),導(dǎo)致益生菌完全不能活化hBD-2啟動(dòng)子。同時(shí)通過使用MAPKs通路的幾種特異性抑制劑,發(fā)現(xiàn)乳酸桿菌誘導(dǎo)hBD-2的表達(dá)在不同程度上依賴ERK 1/2,P38和JNK。表明乳酸桿菌增強(qiáng)腸屏障功能是通過上調(diào)hBD-2的表達(dá),且該上調(diào)機(jī)制是通過NF-κB和AP-1以及MAPK的促炎途徑實(shí)現(xiàn)的[4]。這樣的觀點(diǎn)也被Habil N等[5]的研究所證實(shí),他們發(fā)現(xiàn)由促炎細(xì)胞因子和細(xì)菌產(chǎn)物刺激產(chǎn)生的hBD-2對腸上皮細(xì)胞的免疫反應(yīng)起著非常重要的作用。因此,益生菌可以通過誘導(dǎo)防御素的表達(dá)來增強(qiáng)這種黏膜防御反應(yīng)。

目前,在益生菌與腸道上皮細(xì)胞的相互作用過程中,關(guān)于乳酸桿菌誘導(dǎo)上皮細(xì)胞防御素表達(dá)而提高腸道黏膜的防御功能,從而維持腸道微生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定的報(bào)道較多。2012年,洪智敏等[6]用益生性發(fā)酵乳酸桿菌F6刺激體外培養(yǎng)的雞小腸上皮細(xì)胞時(shí),發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳桿菌F6與雞小腸上皮細(xì)胞相互作用過程中可提高雞β-防御素-9(AvBD9)的表達(dá),且存在劑量依賴性;同年,黎觀紅等[7]用鼠李糖乳酸桿菌LGA刺激體外培養(yǎng)的雞小腸上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)不同濃度的鼠李糖乳酸桿菌LGA均能夠上調(diào)AvBD9的表達(dá),且不同菌液濃度之間AvBD9 mRNA的表達(dá)存在差異,隨后選用刺激效果最好的菌液濃度進(jìn)行不同時(shí)間的刺激發(fā)現(xiàn)存在時(shí)間依賴關(guān)系。而后,賈永杰[8]用鼠李糖乳桿菌MLGA的5種細(xì)胞組分,即細(xì)胞壁完整肽聚糖、脂磷壁酸、全細(xì)胞壁組分、全細(xì)胞壁蛋白、鼠李糖乳桿菌MLGA培養(yǎng)上清刺激原代培養(yǎng)的雞小腸上皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳酸桿菌MLGA的5種細(xì)胞組分均可以不同程度地促進(jìn)AvBD9的表達(dá),且不同細(xì)胞組分之間存在差異性。其中,鼠李糖乳酸桿菌的細(xì)胞壁完整肽聚糖(WPG)促進(jìn)AvBD9基因表達(dá)的能力最強(qiáng),且WPG對基因表達(dá)的促進(jìn)作用同樣呈劑量和時(shí)間依賴性。當(dāng)對鼠李糖乳酸桿菌MLGA及其細(xì)胞壁組分完整肽聚糖調(diào)控AvBD9基因表達(dá)的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行初步探討時(shí),發(fā)現(xiàn)鼠李糖乳酸桿菌、熱滅活鼠李糖乳桿菌MLGA及其細(xì)胞壁組分完整肽聚糖通過TLR-2-NF-κB/AP-1信號通路誘導(dǎo)上皮細(xì)胞 AvBD9的表達(dá),且以 TLR-2-NF-κB為主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。2016年該課題組用鼠李糖乳酸桿菌細(xì)胞壁成分肽聚糖研究刺激雞外周血單核細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)肽聚糖可促進(jìn)雞外周血單核細(xì)胞中AvBD9、Cath-B1基因的表達(dá),且對于不同的基因肽聚糖的最佳刺激濃度不同。鼠李糖乳酸桿菌肽聚糖可促進(jìn)細(xì)胞表面TLR-2受體、胞內(nèi)NOD1、NALP3受體基因的表達(dá),這表明肽聚糖促進(jìn)抗菌肽的表達(dá)可能是由TLR-2或NOD1、NALP3介導(dǎo)。鼠李糖乳酸桿菌肽聚糖可通過TLR-2或NOD1介導(dǎo)的 NF-κB和MAPK信號途徑上調(diào)雞外周血單核細(xì)胞AvBD9、Cath-B1的表達(dá)而發(fā)揮益生作用,從而提高雞抗感染的天然免疫功能[9]。

為了解乳酸桿菌L.casei Zhang和L.plantruam P-8的誘導(dǎo)對綿羊瘤胃上皮細(xì)胞中綿羊β-防御素-1(SBD-1)的調(diào)節(jié)作用,2016年范燕茹[10]用這兩種乳酸桿菌對綿羊瘤胃上皮細(xì)胞的誘導(dǎo)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),這兩種菌均可誘導(dǎo)瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1 mRNA的表達(dá),且存在時(shí)間-劑量依賴性,并且L.plantruam P-8的誘導(dǎo)作用優(yōu)于L.casei Zhang。同時(shí)發(fā)現(xiàn)L.plantruam P-8活菌、熱滅活菌也可促進(jìn)SBD-1基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白分泌,且活菌優(yōu)于熱滅活菌,然而菌培養(yǎng)上清液則未發(fā)現(xiàn)有作用。隨后對L.plantruam P-8誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行初步研究,發(fā)現(xiàn)用L.plantruam P-8活菌刺激細(xì)胞可增加TLR-2、MyD88、NF-κB1、NF-κB2、ERK1/2 和 P38 的基因轉(zhuǎn)錄水平,以及MyD88的蛋白表達(dá)和IκBα、ERK1/2和P38的蛋白磷酸化水平;進(jìn)而通過用TLR-2受體的封閉劑和NF-κB、ERK1/2和P38信號通路的抑制劑預(yù)處理細(xì)胞,結(jié)果顯示,多條信號通路共同參與了L.plantruam P-8誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的過程,而且TLR-2-NF-κB/MAPKs(ERK1/2、P38)通路可能發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。

為了更好的闡明乳酸桿菌與防御素表達(dá)的關(guān)系,學(xué)者們開始研究給動(dòng)物飼喂乳酸桿菌后防御素的表達(dá)變化。2016年 Kusumaningsih T等[11]對Wistar大鼠飼喂羅伊氏乳桿菌后,發(fā)現(xiàn)腮腺上皮中β-防御素-2(rBD-2)和唾液中rBD-2的表達(dá)水平升高。隨后Kobayashi R等[12]在研究牙齦卟啉單胞菌引起小鼠牙周病的時(shí)候,發(fā)現(xiàn)口服加氏乳桿菌SBT2055(LG2055)的小鼠牙齦組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)和分泌顯著降低,而在遠(yuǎn)端黏膜組織和LG2055經(jīng)過的腸道中小鼠β-防御素-14 mRNA及其肽產(chǎn)物顯著增加。此外,通過在牙齦卟啉單胞菌刺激的THP-1單核細(xì)胞中添加hBD-3發(fā)現(xiàn)IL-1β和TNF-α的產(chǎn)生顯著降低。這些結(jié)果表明,口服乳酸桿菌可以通過增強(qiáng)防御素的表達(dá)來提高機(jī)體的黏膜免疫功能,從而預(yù)防疾病的發(fā)生,這些調(diào)節(jié)即可歸因于機(jī)體的先天性免疫。如今的體內(nèi)試驗(yàn)均表明乳酸桿菌可以提高防御素的表達(dá)量,且防御素可以抑制促炎因子的表達(dá)。然而在體內(nèi)試驗(yàn)中飼喂益生菌與防御素表達(dá)的最佳量效和時(shí)效關(guān)系還沒有明確的報(bào)道。因此,在今后的研究中還需對益生菌與防御素表達(dá)的最佳量效和時(shí)效關(guān)系進(jìn)行進(jìn)一步的探索,從而為開發(fā)利用抗菌肽制劑提供理論基礎(chǔ)。

1.2 枯草芽孢桿菌與防御素表達(dá)的關(guān)系 枯草芽孢桿菌作為維持動(dòng)物正常生長繁殖和生理狀態(tài)的重要益生菌,近年來受到越來越多研究者的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),用不同濃度的益生性枯草芽孢桿菌刺激體外培養(yǎng)的綿羊瘤胃上皮細(xì)胞時(shí),當(dāng)菌液濃度為1010CFU/mL,刺激時(shí)間為8 h時(shí)SBD-1的表達(dá)量達(dá)到最高,且在不同的菌液濃度誘導(dǎo)下SBD-1的表達(dá)量均有顯著增加,這表明枯草芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞內(nèi)SBD-1基因的表達(dá)[13]。研究還發(fā)現(xiàn)給兔飼喂混有枯草芽孢桿菌的飼料,兔表現(xiàn)出較好的生長性能和較對照組更高的促炎因子和β-防御素的表達(dá)[14]。這些研究表明,枯草芽孢桿菌誘導(dǎo)β-防御素的表達(dá)可能是加強(qiáng)先天防御機(jī)制的一種新解釋。

1.3 細(xì)菌類益生菌混合物與防御素表達(dá)的關(guān)系 通過使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定8種不同的革蘭陽性生物體組成的凍干混合物VSL#3(長雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、植物乳桿菌和唾液鏈球菌嗜熱亞種)誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞中hBD-2的分泌情況,結(jié)果顯示,細(xì)菌類益生菌混合物具有調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞合成抗菌肽hBD-2的能力。除此之外,VSL#3對Oxazolone小鼠結(jié)腸炎結(jié)腸黏膜中β-防御素-2(mBD-2)的表達(dá)也具有影響,且VSL#3對Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎有治療作用,其作用機(jī)制可能與下調(diào)mBD-2的表達(dá)有關(guān)[15]。在臨床試驗(yàn)中,研究發(fā)現(xiàn)Symbioflor 2(幾種大腸桿菌菌株的混合物)能夠誘導(dǎo)hBD-2的分泌;而且在體外研究中發(fā)現(xiàn)大腸桿菌混合物誘導(dǎo)hBD-2的分泌量是大腸桿菌Nissle 1917的10～15倍[16]。在動(dòng)物試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),給豬同時(shí)飼喂枯草芽孢桿菌和乳酸桿菌混合物能顯著提高十二指腸和回腸β-防御素-2基因的表達(dá)量[17]。因此,在現(xiàn)代的集約化養(yǎng)殖過程中給動(dòng)物同時(shí)飼喂兩種或多種益生菌的混合物可能對腸道黏膜免疫更具有積極的調(diào)節(jié)作用,從而增強(qiáng)宿主的防御能力。

2 真菌類益生菌誘導(dǎo)防御素的表達(dá)

真菌類益生菌一般以酵母為主,酵母細(xì)胞內(nèi)含有豐富的氨基酸、維生素、核酸、微量元素以及各種消化酶。其細(xì)胞壁內(nèi)的多種生物活性物質(zhì)不僅可作為營養(yǎng)物質(zhì)被吸收,而且還可以促進(jìn)免疫反應(yīng),具有益生菌和益生元的某些作用。筆者于2015年研究不同濃度釀酒酵母刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞后SBD-1的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)無論在mRNA水平還是蛋白水平,釀酒酵母均可誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1的表達(dá),且呈濃度-時(shí)間依賴關(guān)系[18]。隨后,本團(tuán)隊(duì)還對釀酒酵母誘導(dǎo)綿羊瘤胃上皮細(xì)胞SBD-1表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行了初步研究,發(fā)現(xiàn)釀酒酵母刺激綿羊瘤胃上皮細(xì)胞后,NF-κB和MAPKs通路中各因子 NF-κB、P38、JNK、ERK1/2、細(xì)胞膜受體 TLR-2與信號銜接蛋白MyD88的mRNA水平與未刺激組相比均有所升高,且呈顯著性差異;通過單獨(dú)或組合添加抑制劑后再誘導(dǎo),均發(fā)現(xiàn)特異性抑制劑PDTC、SB202190、SP600125、PD98059 可極顯著抑制釀酒酵母對SBD-1的上調(diào)作用,且P38通路特異性抑制劑SB202190的抑制效果最明顯。結(jié)果提示,釀酒酵母誘導(dǎo)SBD-1的轉(zhuǎn)錄可能與TLR-2-MyD88-NF-κB/MAPKs通路有關(guān),但可能以 TLR-2-MyD88-MAPKs中的TLR-2-MyD88-P38通路為主要的信號通路[19]。因此,NF-κB和 MAPKs通路作為參與抗炎免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,其在益生菌誘導(dǎo)抗菌肽表達(dá)的過程中也發(fā)揮著重要作用,這也從益生性酵母菌誘導(dǎo)SBD-1表達(dá)的新角度解析了酵母菌在體內(nèi)是如何發(fā)揮益生作用的。

研究表明,益生菌主要通過其細(xì)胞壁成份影響免疫系統(tǒng)[20],而酵母細(xì)胞壁主要由葡聚糖和甘露聚糖兩種多糖組成,且兩種多糖占細(xì)胞壁干重的85%左右。衍生自釀酒酵母細(xì)胞壁的β-葡聚糖具有免疫調(diào)節(jié)活性,能夠有效地增強(qiáng)哺乳動(dòng)物先天性免疫反應(yīng)[21-24],Marel Mv等[25]發(fā)現(xiàn)從釀酒酵母細(xì)胞壁中提取出來的β-葡聚糖對鯉魚黏膜組織中β-防御素-1和β-防御素-2基因表達(dá)都有影響;Schmitt P等[26]用酵母細(xì)胞壁成分酵母聚糖在鱒魚腸上皮細(xì)胞RT-gutGC細(xì)胞系上的研究發(fā)現(xiàn),酵母聚糖在mRNA和蛋白水平上增加了宿主防御肽cathelicidin的表達(dá);2017年Campoverde等[27]研究同樣發(fā)現(xiàn),在魚體內(nèi)給予β-葡聚糖能夠上調(diào)β-防御素表達(dá)水平,且在腸道和鰓中防御素表達(dá)高于腎臟。因此,筆者猜測抗菌肽主要是由腸上皮細(xì)胞表達(dá)并發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,從而通過免疫刺激劑改善局部腸道的免疫反應(yīng)。而對白色念珠菌、白色念珠菌細(xì)胞壁提取物以及純甘露聚糖對人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)hBD-2 mRNA表達(dá)影響的研究發(fā)現(xiàn),其均可以使hBD-2 mRNA的表達(dá)增強(qiáng),但白色念珠菌培養(yǎng)上清液和細(xì)胞漿提取物對hBD-2表達(dá)無明顯影響[28]。由此提示,細(xì)胞壁成分甘露聚糖可能是誘導(dǎo)防御素表達(dá)的主要活性成分,同時(shí)角質(zhì)形成細(xì)胞通過表達(dá)hBD-2在皮膚黏膜的抗感染防御機(jī)制中發(fā)揮重要作用。

3 展望

益生菌可以增強(qiáng)正常組織和細(xì)胞表達(dá)防御素,從而提高機(jī)體預(yù)防病原微生物侵襲的能力;也可以下調(diào)由各種內(nèi)外因素刺激引起的防御素高表達(dá),從而減輕防御素過度表達(dá)引起的紊亂。然而就目前研究來看,益生菌調(diào)控機(jī)體防御素在適宜范圍內(nèi)表達(dá)以達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的機(jī)制尚不是十分清楚,且納入研究的益生菌種類較少,多局限于乳酸桿菌及其有效成分,而其他益生菌比較少見。防御素作為固有免疫的重要組成成分,是機(jī)體自身的一種活性物質(zhì),相對不具有免疫原性,抗菌譜廣且難以產(chǎn)生抗性突變,可能替代抗生素為人類提供全新的抗感染治療方法,應(yīng)用前景廣闊。采用益生菌相比其他誘導(dǎo)劑而言較安全、易于獲得且價(jià)格低廉,而基因工程技術(shù)合成防御素難度較大。因此,今后的研究更應(yīng)該致力于擴(kuò)大益生菌研究范圍,深入研究益生菌調(diào)控防御素表達(dá)的機(jī)制,為發(fā)展畜牧業(yè)、造福人類不斷探索。