封忠昕 陳 琦 閔 迅 龔玉萍 袁 鐘 黃 銳 陳 迪 王 虹 馮 進(jìn)

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，貴州 遵義 563003)

急性髓系白血病(AML)是較常見的急性白血病，極易引起患者復(fù)發(fā)及死亡〔1〕?？扇苄訡D40配體(sCD40L)可通過阻滯多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞/白血病(Bcl)-2于G0/G1期，從而明顯誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔2〕。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度sCD40L處理白血病HL-60細(xì)胞后，Bcl-2、生存素(survivin)及白細(xì)胞介素6表達(dá)下降，CD95表達(dá)上升，推測可能是通過死亡受體和線粒體信號等途徑抑制白血病細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡〔3，4〕。本實(shí)驗(yàn)分析sCD40L對人白血病急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(THP)-1細(xì)胞凋亡、周期的影響及其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 白血病THP-1細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海生命研究院細(xì)胞資源中心，胎牛血清和RPMI1640購自美國Gibco公司；sCD40L購自以色列ProSpec公司；RNA提取試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒及引物均購自TaKaRa生物工程公司。細(xì)胞周期檢測試劑盒購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Bcl-2、半胱天冬酶(caspase)-3一抗(小鼠抗人)購自美國Cell Signaling Technology，Inc(CST)公司；二抗(羊抗兔)購自美國Santa Cruz公司。

1.2方法 細(xì)胞THP-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。分為空白組(對照組)：不加任何藥物干預(yù)組;sCD40L實(shí)驗(yàn)組：sCD40L濃度2.0、4.0和6.0 μg /ml。

1.3流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞凋亡率 收集實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗2次，每管加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞后加入5 μl Annexin V-FITC進(jìn)行染色，混勻，加入PI 5 μl室溫避光孵育15 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.4FCM檢測細(xì)胞周期 收集實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞，PBS洗2次，-20℃預(yù)冷70%乙醇固定過夜。上機(jī)前用PBS洗2次，100 μl PBS重懸細(xì)胞加入2 μl RNA酶，37℃孵育15 min，再用PBS洗，100 μl PBS重懸細(xì)胞，加入PI 5 μl，室溫避光孵育5 min，最后加入PBS至500 μl體積，混勻后上機(jī)檢測。

1.5Bcl-2及caspase-3 mRNA測定 提取收集實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞的RNA。反應(yīng)體系：試劑5×Prime ScriptTM緩沖液(用于實(shí)時熒光定量)使用量6.0 μl；Prime ScriptTMRT酶混合物Ⅰ 1.5 μl；Random 6 mers(100 μmol/L)1.5 μl;Oligo Dt Primer(50 μmol/L)1.5 μl;總RNA 19.5 μl;總反應(yīng)體積為30 μl。37℃ 15 min逆轉(zhuǎn)錄，85℃ 5 s滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放置-20℃冰箱保存。按說明進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR，取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)總體積為20 μl，內(nèi)含SYBR?Premix Ex TaqTM10 μl，引物混合液(上游、下游引物)1 μl，1‰焦碳酸二乙酯(DEPC)水8 μl。 預(yù)變性 95℃ 30 s 1個循環(huán)，PCR反應(yīng) 95℃ 5 s；60℃ 30 s，40個循環(huán)。β-actin上游引物：TGGCACCCAGCACAATGATGA，下游引物：ACTAAGTCATAGTCGCCTAGAAGCA；Bcl-2上游引物：CGACGACTTCTCCCGCCGCTACCGC，下游引物：CCGCATGCTG-GGGCCGTACAGTTCC；caspase-3上游引物：GACTCTGGAATATCCCTGGACAACA，下游引物：AGGTTTGCTGCATCGACATCTG。結(jié)果以2-△△Ct相對值來反映基因表達(dá)的改變。

1.6Bcl-2及caspase-3蛋白表達(dá)的測定 收集實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞，PBS洗2次，加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min后取上清，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白含量。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。用脫脂奶粉室溫下封閉1 h，加入一 抗，孵育4℃過夜，再與二抗室溫孵育2 h，最后電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒顯色后曝光檢測分析，β-actin作為內(nèi)參，分析各組蛋白表達(dá)情況。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度sCD40L對HL-60細(xì)胞凋亡的影響 不同濃度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率由(34.26±2.05)%、(51.37±3.64)%上升到(65.82±4.76)%，與對照組(22.54±1.63)%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2不同濃度sCD40L對THP-1細(xì)胞周期的影響 不同濃度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1細(xì)胞48 h后，白血病細(xì)胞停滯于G0/G1期，隨著sCD40L濃度增加，THP-1細(xì)胞處于G0/G1期的比例從(73.45±6.08)%、(76.32±7.14)%上升到(85.27±6.96)，與對照組(60.33±5.21)%比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3Bcl-2、caspase-3 mRNA及蛋白水平的變化 不同濃度(2.0、4.0、6.0 μg/ml)sCD40L作用白血病THP-1細(xì)胞48 h后，Bcl-2 mRNA表達(dá)從(47.96±4.03)、(31.78±2.65)下降到(15.09±1.12)，與對照組(62.17±4.98)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；Bcl-2蛋白表達(dá)從(2.38±0.21)、(1.62±0.13)下降到(0.97±0.05)，與對照組(2.96±0.18)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；caspase-3 mRNA表達(dá)從(20.17±1.77)、(42.36±3.02)上升到(51.16±4.39)，與對照組(5.21±0.48)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；caspase-3蛋白表達(dá)從(1.25±0.11)、(1.83±0.15)上升到(2.34±0.17)，與對照組(0.49±0.02)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

AML是起源于造血干細(xì)胞的惡性血液腫瘤，病情常發(fā)展迅速，靶向治療是目前認(rèn)為較為可取的發(fā)展方向〔5〕。在實(shí)體瘤尤其是肺癌研究中，sCD40L抗腫瘤作用得到研究者較一致認(rèn)同〔6〕。另外在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中，sCD40L可顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤、淋巴細(xì)胞白血病的體外增殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)G1期阻滯，從而誘導(dǎo)骨髓瘤細(xì)胞及白血病細(xì)胞凋亡〔2〕。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步印證了sCD40L具有抗白血病作用。

Bcl-2是較常見的抗凋亡因子之一，在細(xì)胞線粒體凋亡途徑中發(fā)揮極為重要的作用，可用于檢測腫瘤細(xì)胞凋亡程度和藥物療效的評價〔7〕。在乳腺癌、腎透明細(xì)胞癌等Bcl-2高表達(dá)與腫瘤發(fā)生及發(fā)展相關(guān)〔8,9〕。在急性白血病方面，有研究表明Bcl-2的表達(dá)在完全緩解組和正常對照組低于初治和難治復(fù)發(fā)組〔10〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明sCD40L抗白血病作用與Bcl-2密切相關(guān)。國外已研究應(yīng)用Bcl-2抑制劑治療AML〔11〕。

caspase-3在各種腫瘤中表達(dá)不一，如在食管癌、乳腺癌等多種腫瘤組織中低表達(dá)，而在卵巢漿液性癌中高表達(dá)，可能由于腫瘤種類不同等原因?qū)е隆?2～14〕。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，予雷帕霉素等處理白血病K562細(xì)胞后，可通過激活caspase-3從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明sCD40L抗白血病作用與caspase-3有關(guān)，與Liu等〔16〕予苦參堿干預(yù)白血病THP-1細(xì)胞后，通過激活caspase-3誘導(dǎo)凋亡，阻滯白血病細(xì)胞于G0/G1期一致。

綜上，在一定濃度范圍內(nèi)，sCD40L 在體外能夠阻滯白血病THP-1細(xì)胞在G0/G1期，其可能機(jī)制是通過下調(diào)Bcl-2及激活caspase-3，線粒體凋亡途徑發(fā)揮重要作用。