楊 揚(yáng) ，白 虹 ，辛靈彪

（1.天津市血液中心，天津300110；2.天津醫(yī)科大學(xué)免疫學(xué)系,天津300070；3.天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，天津300070）

卵巢上皮性癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首，其發(fā)生發(fā)展的機(jī)制一直被廣泛研究探討。卵巢在盆腔內(nèi)位置很深，卵巢上皮性癌的起病非常隱匿，早期無(wú)臨床癥狀，診斷難度很大，且該病治療困難，即便采用聯(lián)合化療也很難提高5年生存率[1]。人類SND1（staphylococcal nuclease and tudor domain containing 1）蛋白在乳腺癌、前列腺癌、直腸結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞惡性腫瘤中均有過(guò)度表達(dá)[2]。分子生物學(xué)的研究已經(jīng)揭示了SND1蛋白的多功能性，包括其參與基因轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[3]，構(gòu)成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物（RNA-induced silencing complex,RISC）[4]， 調(diào) 節(jié)mRNA的剪切、編輯和穩(wěn)定[5]，保持細(xì)胞活性等[6]。SND1所具有的這一系列復(fù)雜的分子功能可能是它

促進(jìn)癌癥發(fā)生的機(jī)制。然而SND1與卵巢上皮性癌的發(fā)生是否有關(guān)聯(lián)尚不清楚，因此SND1是否促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生以及其具體機(jī)制值得探討。本研究使用SND1慢病毒感染并篩選出能穩(wěn)定表達(dá)SND1的OVCAR3細(xì)胞株，為進(jìn)一步探討SND1在卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料和試劑 人卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3和293T細(xì)胞系均為本實(shí)驗(yàn)室保存。OVCAR3細(xì)胞系用含0.01 mg/mL胰島素、20%胎牛血清（BI公司）的1640培養(yǎng)基（BI公司）常規(guī)培養(yǎng)，293T細(xì)胞系用含10%胎牛血清（BI公司）的DMEM培養(yǎng)基（BI公司）常規(guī)培養(yǎng)。慢病毒載體質(zhì)粒pLVX-FLAGSND1由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。包裝質(zhì)粒1（pMD2.G）和包裝質(zhì)粒2（psPAX2）由天津醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室提供。Ampicillin和Hygromycin B購(gòu)自羅氏公司。轉(zhuǎn)染試劑Polyethyleneimine購(gòu)自Sigma公司。鼠源SND1單克隆抗體由本實(shí)驗(yàn)室制備。鼠源FLAG M2抗體購(gòu)自Sigma公司。辣根過(guò)氧化氫酶標(biāo)抗鼠IgG購(gòu)自美國(guó)KPL公司。BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Pierce公司。ECL Western顯色試劑盒購(gòu)自碧云天公司。

1.2 Hygromycin B最低致死濃度測(cè)定 按3×105/孔將OVCAR3細(xì)胞接種于24孔板上，24 h細(xì)胞貼壁后，按 0、0.5、1、1.25、1.5μg/mL 濃度梯度將 Hygromycin B加入每孔中，共設(shè)3組重復(fù)。培養(yǎng)3d后結(jié)果顯示，Hygromycin B對(duì)OVCAR3細(xì)胞的最低致死濃度為1 μg/mL，所以選擇 1 μg/mL 的 Hygromycin B 進(jìn)行抗藥篩選。

1.3 慢病毒毒粒制備 準(zhǔn)備293T細(xì)胞，待混合率為70%～80%左右準(zhǔn)備包裝病毒。轉(zhuǎn)染前1 d將293T細(xì)胞接種于10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于含10%FES的高糖DMEM培養(yǎng)基，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將重組質(zhì)粒分別與包裝質(zhì)粒1（pMD2.G)和包裝質(zhì)粒 2（psPAX2）按照體系比（μg）22.5∶7.9∶14.6加入500 μL opti-MEM中混勻，另用500 μL opti-MEM將100 μL轉(zhuǎn)染試劑Polyethyleneimine混勻,后在37℃加熱使其完全溶解。將混有質(zhì)粒的opti-MEM加入至混有Polyethyleneimine的opti-MEM中，輕彈混勻，室溫靜置5～20 min。取出事先鋪好的293 T細(xì)胞，棄舊培養(yǎng)基，加入10 mL新完全培養(yǎng)基，再將混合好的質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑的opti-MEM逐滴緩慢加入至新培基中，4～6 h后換液。24 h后收病毒上清至離心管，4℃保存。后更換新的完全培基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后再收集病毒上清至同一離心管中，4℃500×g離心10 min后，用0.45 μm的濾器過(guò)濾，置于-80℃長(zhǎng)期保存用于感染。

1.4 OVCAR3細(xì)胞的感染及穩(wěn)定株篩選 準(zhǔn)備待轉(zhuǎn)染慢病毒的目的細(xì)胞OVCAR3，轉(zhuǎn)染前24 h以1×106/孔鋪到6孔板中，使其融合率為60%左右。將制備好的病毒液緩慢加入培養(yǎng)皿中，再加200 μL FBS和12 μg polybrene。感染24 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基。48 h后加入1 μg/mL Hygromycin B進(jìn)行篩選，并且以不加慢病毒、只加藥的OVCAR3細(xì)胞培養(yǎng)基做對(duì)照，此皿細(xì)胞全部死亡即為篩選完成。FLAG-SND1病毒感染組稱為OVCAR3-pLVXFLAG-SND1，空載體包裝病毒感染組稱為OVCAR3-pLVX。

1.5 Western blot檢測(cè)FLAG-SND1表達(dá)量 重組質(zhì)粒包裝毒粒感染目的細(xì)胞OVCAR3，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株檢測(cè)相應(yīng)SND1蛋白表達(dá)量。用RIPA裂解重組慢病毒感染的OVCAR3細(xì)胞（OVCAR3-pLVXFLAG-SND1）離心取上清作為樣品，野生型OVCAR3細(xì)胞（OVCAR3-CN）裂解液作為陰性對(duì)照，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定樣品蛋白濃度，取等量蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)印至PVDF膜后，用5%脫脂奶粉封閉，一抗、二抗孵育后，加入曝光底物進(jìn)行曝光。Western blot以β-actin為內(nèi)參。

2 結(jié)果

OVCAR3慢病毒穩(wěn)定株的篩選與鑒定：選取包裝病毒感染 OVCAR3細(xì)胞，48 h后加 1 μg/mL Hygromycin B進(jìn)行篩選。3 d后，不加慢病毒只加藥的細(xì)胞全部死亡，結(jié)束篩選，將OVCAR3慢病毒穩(wěn)定株凍存保存。剩余的細(xì)胞制備成細(xì)胞裂解液，Western印跡鑒定SND1蛋白表達(dá)情況，同時(shí)選擇野生型OVCAR3細(xì)胞作為空白對(duì)照，見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示OVCAR3穩(wěn)定株的SND1蛋白表達(dá)明顯增加，證明OVCAR3慢病毒穩(wěn)定株構(gòu)建成功。

圖1 OVCAR3慢病毒穩(wěn)定株Western-blot表達(dá)鑒定圖Fig 1 The expression level of SND1 detected by western-blot

3 討論

SND1蛋白分子量為100 kDa，所以又稱之為p100蛋白，它的N端由4個(gè)相同結(jié)構(gòu)的葡萄球菌核酸酶樣 （staphylococcal nucleases-like，SN-like）的SN結(jié)構(gòu)組成，C端具有Tudor-SN5(TSN)結(jié)構(gòu)域，所以又被稱為T(mén)udor-SN（Tudor staphylococcal nuclease）蛋白[7]。SND1是一種具有復(fù)雜功能的蛋白，它參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控和轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)，維持mRNA的穩(wěn)定，參與mRNA的剪切以及維持細(xì)胞活性等[4-6]。1995年，SND1作為EB病毒核蛋白2(Epstein-Barr virus nuclear protein 2，EBNA2)的轉(zhuǎn)錄協(xié)同調(diào)控因子被首次發(fā)現(xiàn)[8]。EBNA2可以激活轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。SND1是STAT5和STAT6的轉(zhuǎn)錄激活因子，SND1的SN端結(jié)構(gòu)和Tudor端結(jié)構(gòu)共同參與STAT5的協(xié)同免疫作用，但是只有SN端結(jié)構(gòu)參與STAT6的活化[9]。SND1還作為一個(gè)銜接分子建立起CREB蛋白（cAMP-response element binding protein）和STAT6之間的橋梁。本實(shí)驗(yàn)室之前破解了SND1蛋白N端TSN結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)，并且證實(shí)SND1不僅參與基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控，還可以促進(jìn)剪接體的裝配和pre-mRNA剪接加工過(guò)程。另外，SND1在RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex,RISC)中發(fā)揮核酸酶樣作用來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)水平，從而影響siRNA和miRNA的表達(dá)[10]。研究證明，SND1增強(qiáng)了RISC的活性可能會(huì)促進(jìn)癌癥的形成。

通過(guò)對(duì)SND1敲除的小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)SND1蛋白通過(guò)影響基因表達(dá)在胚胎形成和細(xì)胞分化的早期發(fā)揮關(guān)鍵性作用[11]。越來(lái)越多的研究證實(shí)SND1蛋白的過(guò)度表達(dá)與促進(jìn)癌癥形成有關(guān)，它的具體機(jī)制有待深入研究。SND1是RISC復(fù)合物的組成成分，而RISC與肝細(xì)胞癌的發(fā)展息息相關(guān)。SND1通過(guò)多種方式影響著肝癌形成，大多數(shù)肝細(xì)胞癌患者血液中的SND1呈現(xiàn)高表達(dá)，并且升高的程度與肝癌的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]；進(jìn)一步的研究證實(shí)，SND1蛋白的過(guò)度表達(dá)能促進(jìn)癌癥的侵襲、增殖、轉(zhuǎn)移和血管再生。在一個(gè)乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移模型中普遍檢測(cè)出SND1表達(dá)的上調(diào)，大量臨床數(shù)據(jù)顯示，SND1的表達(dá)水平與乳腺癌肺轉(zhuǎn)移的發(fā)生率和生存率相關(guān)；星型膠質(zhì)細(xì)胞上調(diào)基因1（astrocyte elevated gene-1，AEG-1)作為一種致瘤性的細(xì)胞因子影響著腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、血管再生、抗藥性和細(xì)胞凋亡，SND1已被證實(shí)與AEG-1相互作用。c-Myb是一種不成熟的造血干細(xì)胞的變異生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)乳腺癌的淋巴轉(zhuǎn)移，它的功能也早已發(fā)現(xiàn)與SND1蛋白相關(guān)，在出現(xiàn)轉(zhuǎn)移的患者中，c-Myb與SND1同時(shí)高表達(dá)。在174例前列腺癌患者的研究中，發(fā)現(xiàn)SND1蛋白與癌癥的組織學(xué)分期呈正相關(guān)。SND1與結(jié)腸直腸癌也極具相關(guān)性，從196例結(jié)腸癌的免疫組織化學(xué)的分析得出，伴隨著腫瘤分期和疾病的進(jìn)展，細(xì)胞質(zhì)表達(dá)SND1和AEG-1蛋白也逐漸增多[13]。在結(jié)腸癌患者中，SND1通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的修飾下調(diào)了結(jié)腸腺瘤息肉易感基因（adenomatousPolyposis Coli，APC）的蛋白表達(dá)水平，破壞了細(xì)胞極性和細(xì)胞間的粘附力。最近的一項(xiàng)關(guān)于惡性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞腫瘤的研究發(fā)現(xiàn)，患者大腦中SND1 mRNA的水平較正常人顯著升高，這可以為該病的治療提高新的靶點(diǎn)[14]。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)通路可以調(diào)控SND1蛋白的表達(dá)。鑒于現(xiàn)有的報(bào)道，SND1在多種惡性疾病中均有異常表達(dá)，我們推測(cè)SND1在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中也可能發(fā)揮一定的調(diào)控作用。

慢病毒載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的一種亞型，是在HIV-1病毒基礎(chǔ)上改建而來(lái)的病毒載體系統(tǒng)，能將目的基因高效地導(dǎo)入人或者動(dòng)物的原代細(xì)胞或細(xì)胞系中。慢病毒載體基因組是正鏈RNA，目的基因整合到宿主細(xì)胞基因組中，可以隨著細(xì)胞基因組的分裂而分裂，因此慢病毒介導(dǎo)的基因表達(dá)持續(xù)而且穩(wěn)定[15]。本實(shí)驗(yàn)利用慢病毒表達(dá)載體pLVX-FLAGSND1與慢病毒包裝質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在細(xì)胞中進(jìn)行慢病毒包裝。用包裝好的慢病毒顆粒感染OVCAR3細(xì)胞，經(jīng)過(guò)抗藥性篩選，建立過(guò)表達(dá)SND1的OVCAR3穩(wěn)定株。通過(guò)Western印跡鑒定證實(shí)SND1在慢病毒毒粒感染后的OVCAR3細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)，證實(shí)已成功構(gòu)建OVCAR3慢病毒穩(wěn)定株。

本次實(shí)驗(yàn)成功地構(gòu)建了能夠穩(wěn)定表達(dá)SND1的OVCAR3穩(wěn)定株，為從分子水平上研究SND1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的調(diào)控作用提供了體外細(xì)胞系模型，為研究SND1與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究卵巢癌的治療提供了新的方向。

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