于明航 ，李 楊 ，閻 晗 ，王 瑾 ，黃 珊 ，袁順宗 ，尹 潔 ，李澤興 ，王 璽

（1.天津醫(yī)科大學(xué)細胞生物學(xué)系，天津300070；2.中國人民解放軍307醫(yī)院頭頸腫瘤科,北京100853）

自然殺傷細胞（natural killer cells，NK cells）是機體進行免疫防疫的第一道防線，主要是抵抗細菌、真菌、病毒以及病原微生物的入侵[1-3]，同時NK細胞在抗腫瘤免疫方面也扮演著重要的角色[4-6]。但是NK細胞在發(fā)育和功能等方面還有許多的未知機制。利用轉(zhuǎn)基因小鼠研究NK的發(fā)育與功能是一個

非常有效的工具。NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是對表達NKp46受體的NK細胞進行特異性敲除的工具鼠[7-8]。在本次研究中，主要是利用ROSA26R-YFP小鼠與NKp46-Cre小鼠雜交，通過對小鼠體內(nèi)細胞YFP的表達驗證NKp46-Cre的敲除效率以及是否具有特異性，目的是構(gòu)建YFP基因報告系統(tǒng)，為進一步研究NK細胞的功能與發(fā)育做好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 ROSA26R-YFP轉(zhuǎn)基因小鼠（哈佛醫(yī)學(xué)院惠贈），NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠（中國解放軍307醫(yī)院袁順宗老師惠贈）；鼠尾堿性裂解液（25 mmol/L NaOH；EDTA．Na20．2 mol/L），鼠尾酸性中和液（Tris-HCl 40 mmol/L，pH=5）Tag DNA 聚合酶（康成）；普通PCR 儀（ABI）；流式細胞儀（BD）；Percific Blue-CD3e（BD），APC-CD19（BD）；PE-NKp46（BD）；引物由北京奧科合成，引物序列見表1。

表1PCR引物Tab 1 PCR primers

1．2 實驗方法

1．2．1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠與NKp46-Cre（+/-）小鼠雜交，子代在出生25 d左右進行耳標編號，并剪鼠尾進行基因型鑒定。將鼠尾浸泡含有75 μL的堿性裂解液的離心管中，將離心管置于100℃金屬水浴鍋30 min；冰上裂解5 min；5 min后向樣品中加入75 μL的酸性中和液并將鼠尾吹打均勻，Nanodrop 2000測濃度；按照Tag DNA聚合酶試劑盒進行配制PCR體系；95℃10 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃10 min。PCR產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠電泳進行，結(jié)束后在凝膠成像儀中記錄結(jié)果。

1．2．2 流式細胞術(shù)檢測各個組織器官YFP的表達 頸椎脫臼法處死ROSA26R-YFP（+/+）NKp46-Cre（+/-）和 ROSA26R-YFP（-/-）NKp46-Cre（-/-）的小鼠，分別取兩種小鼠的脾臟、骨髓、淋巴結(jié)和心臟，將組織在1640培養(yǎng)基中研磨，用細胞篩網(wǎng)過濾，制成單個懸浮細胞，通過細胞計數(shù)，選取1×106個細胞進行流式上機，最后用FlowJo軟件進行分析。

1．2．3 流式細胞術(shù)檢測脾臟中各個免疫細胞的YFP的陽性效率 按1．2．2的方法提取脾臟的淋巴細胞；將YFP雙陽性的帶有NKp46-Cre的小鼠淋巴細胞每1×106個細胞制成單個懸浮細胞于3個管，分別標記 CD3、CD19、NKp46；分別加入1μL 抗體標記的 Percific Blue-CD3e，APC-CD19，PE-NKp46，并且每管都加入1 μL NKp46的抗體，室溫避光30 min；300g，5min離心收集細胞，最后用 300μL 的PBS重懸，另外需要一個含有2×106個細胞Negative管，500 μL PBS重懸，最后將樣品轉(zhuǎn)入流式管，準備流式上機，最后用 FlowJo（7．6）軟件進行分析。

1．3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS20．0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間樣品均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 基因型鑒定 ROSA26R-YFP（+/-）小鼠與NKp46-Cre（+/-）小鼠雜交后代共有14只小鼠，提取基因組DNA并進行基因型鑒定。已知YFP野生型的PCR條帶為600 bp（YFP-），而YPF陽性的PCR條帶為320 bp（YFP+），Cre野生型的PCR條帶為454bp（Cre-），而YPF陽性的PCR條帶為282bp（Cre+），基因型結(jié)果鑒定見圖1、表2。根據(jù)表格選擇對照組和實驗組。

圖1ROSA2R-YFP(+/-)與NKp46-Cre（+/-）雜交小鼠后代基因型鑒定結(jié)果Fig 1 The YFP genotyping results of the hybrid mice ROSA26RYFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

表2ROSA2R-YFP(+/-)與NKp46-Cre（+/-）雜交小鼠后代基因型鑒定結(jié)果Tab 2 ThegenotypingresultsofthehybridmiceROSA26R-YFP(+/-)and NKp46-Cre（+/-）

2.2 各個組織器官中YFP陽性的表達 流式細胞術(shù)檢測根據(jù)基因型鑒定結(jié)果分成的實驗組ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）和對照組ROSA26R-YFP(-/-)NKp46-Cre（-/-）小鼠的免疫器官（脾臟、淋巴結(jié)、骨髓）和非免疫器官（心臟）中細胞YFP陽性的表達，見圖2。雙陽性小鼠淋巴結(jié)、骨髓、脾臟中YFP的陽性細胞數(shù)百分比分別為0.589%±1.02%、1.89%±1.28%、4.53%±1.54%；陰性對照 YFP（-/-）Cre（-/-）小鼠相對應(yīng)的器官 YFP 陽性百分比分別為0.008%±0.003%、0.126%±0.08%、0.12%±0.004%；與對照組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。兩組小鼠的心臟細胞中基本沒有YFP的表達，其中YFP的表達百分比分別為 0.009%±0.0002%、0.03%±0.012%，兩組之間沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異。NKp46-Cre介導(dǎo)的YFP的表達在免疫器官中具有特異性。

圖2 免疫器官（淋巴結(jié)、骨髓、脾臟）和非免疫器官（心臟）的YFP表達情況Fig 2 The expression levels of YFP in immune organs and non-immune organs

2.3 脾臟淋巴細胞系中YFP陽性的表達效率 流式細胞術(shù)檢測ROSA26R-YFP(+/+)NKp46-Cre（+/-）小鼠脾臟中淋巴細胞系（T cells、B Cells、NK cells）的YFP標記陽性細胞的百分比。ROSA26R-YFP陽性細胞標記NK細胞、T細胞、B細胞的百分比，分別為89.4%±1.08%、0.89%±0.56%、0.82%±0.82%，在各種細胞中差異均有統(tǒng)計學(xué)意義，說明NKp46-Cre系統(tǒng)介導(dǎo)的YFP熒光報告系統(tǒng)可以準確代表小鼠體內(nèi)的NK細胞（圖3）。

圖3 免疫器官脾臟淋巴細胞系中YFP的表達情況Fig 3 The percentages of YFP in spleen lymphocyte lineage of immune organ

3 討論

自然殺傷細胞是固有免疫系統(tǒng)中一類重要的免疫細胞，它主要分布于次級淋巴組織器官以及外周血中[9-11]，NK細胞不像T細胞，它不需要預(yù)先致敏就能發(fā)揮殺傷作用或分泌細胞因子、趨化因子等能力[12-14]。截止到目前為止，對NK細胞的發(fā)育分化以及功能方面的調(diào)控仍然存在很多的未知，而現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小鼠的應(yīng)用，對于NK細胞的進一步研究提供了非常有效的工具。

NKp46-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠是一種專門介導(dǎo)表達NKp46受體的NK細胞的敲除小鼠[7]?，F(xiàn)階段，Cre重組酶介導(dǎo)的基因敲除檢測主要集中在基因組的基因型鑒定，RT-PCR以及Western等技術(shù)在DNA、mRNA和蛋白水平上進行驗證，而這些實驗對于做免疫功能實驗較為困難，并且不利于活體實驗的研究。因此，在本次實驗中引入了ROSA26R-YFP熒光報告基因小鼠與NKp46-Cre小鼠雜交，借助Cre重組酶系統(tǒng)切除ROSA26R-YFP熒光報告基因前面的終止子從而表達YFP蛋白[15]，形成觀察NK細胞的一種有效手段。

在本次實驗中，我們得到了ROSA26R-YFP（+/-）或ROSA26R-YFP（+/+）的NK細胞，并且在各個免疫器官（脾臟、淋巴結(jié)、骨髓）中得到Y(jié)FP的陽性表達，證實了YFP陽性NK細胞的陽性表達率在80%以上，而在ROSA26R-YFP（+/+）純合的小鼠中的陽性率更高達90%左右。雖然YFP標記NK細胞并不是100%，可能還是與Cre重組酶的敲除效率有關(guān)，但其結(jié)果證實YFP陽性細胞可代表NK細胞，為了以后進一步的研究我們會采取ROSA26R-YFP（+/+）純合的小鼠進行實驗。

綜上所述，本次實驗結(jié)果表明YFP基因報告系統(tǒng)可行，在以后的實驗中可以選擇YFP陽性的細胞進行實驗，對NK細胞的發(fā)育進行實時監(jiān)測，有利于分析NK細胞的分化和增殖，而對于功能方面利用YFP陽性細胞進行殺傷實驗，也有著重要的作用，因此，這個系統(tǒng)的建立可以更加深入地探討NK細胞地發(fā)育和功能方面的問題，為免疫細胞的研究提供了方向。

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