范敏娟,鐘云華,沈 雯△,袁開芬,趙國厚,王蜀昆,溫林俏

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸科，昆明 650101；2.云南省第一人民醫(yī)院干療科，昆明 650101)

肺癌發(fā)病機(jī)制較復(fù)雜，涉及多種細(xì)胞因子的改變，白細(xì)胞介素-10(IL-10)是一種重要的炎性細(xì)胞因子，主要來源于單核巨噬細(xì)胞和各種T細(xì)胞亞群，研究表明，隨著肺癌分期越晚，IL-10的表達(dá)水平越高[1]，IL-10水平可預(yù)示肺癌病情的嚴(yán)重性。研究證實(shí)熱休克轉(zhuǎn)錄因子1(HSF1)與腫瘤的發(fā)生有關(guān)[2]，過表達(dá)HSF1可激活巨噬細(xì)胞IL-10基因的啟動(dòng)子誘導(dǎo)IL-10 mRNA的表達(dá)[3]。HSF2作為另一類轉(zhuǎn)錄因子，可以結(jié)合至熱休克蛋白(HSP)90的啟動(dòng)子區(qū)域上調(diào)其表達(dá)[4]，而HSP90α在肺癌中高表達(dá)[5]?？梢?，HSF2與肺癌的發(fā)生有關(guān)。而且，在潰瘍性結(jié)腸炎的研究中發(fā)現(xiàn)，HSF2既可直接啟動(dòng)炎性因子的表達(dá)，也可通過炎性反應(yīng)相關(guān)信號(hào)通路來調(diào)節(jié)炎性因子的生成[6]。本研究通過檢測(cè)肺癌組織和癌旁組織中HSF2、IL-10兩種因子的mRNA、蛋白的表達(dá)情況，觀察HSF2對(duì)IL-10表達(dá)的影響，探討HSF2通過促進(jìn)IL-10的表達(dá)對(duì)肺癌發(fā)生的影響。

1 材料與方法

1.1材料 IL-10、HSF2試劑盒(上海艾博抗生物有限公司)，組織總RNA提取試劑盒、引物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒(北京天根生化科技有限公司)，A549細(xì)胞(中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫)，羅氏siRNA轉(zhuǎn)染試劑盒(廣州聚研生物科技有限公司)，3%牛血清白蛋白、PVDF膜、蛋白酶抑制劑、DMEM培養(yǎng)基(上海維森特生物技術(shù)有限公司)，生物素化山羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶親和素、RIPA裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，DMEM培養(yǎng)基、封閉用山羊血清、蘇木精-伊紅(HE)(北京索萊寶科技有限公司)等。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本來源及分組 標(biāo)本從昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院及云南省第一人民醫(yī)院獲取。在手術(shù)獲取腫瘤組織的同時(shí)，從距離腫瘤組織大于6 cm的組織中獲取相應(yīng)癌旁組織作為對(duì)照組，各獲取標(biāo)本50例。癌旁組織經(jīng)過組織學(xué)分析確認(rèn)沒有腫瘤細(xì)胞浸潤。所有患者術(shù)前均未經(jīng)過任何治療，取材時(shí)將所取組織用預(yù)冷的DEPC處理后的雙蒸水沖洗兩遍后，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本的采集均征得患者本人及其家屬的同意并簽署手術(shù)同意書。

1.2.2RT-PCR檢測(cè)mRNA 使用組織總RNA提取試劑盒提取組織RNA，第一鏈cDNA合成采用cDNA合成試劑盒。HSF2 RT-PCR引物，如下：正向引物5′-AAG TTC AGG CAG TGA TGG CA-3；反向引物5′-TGC ACA GAA CTA GTG AAA AGA TCA-3′。IL-10 RT-PCR引物，如下：正向引物5′-ACA TCA AGG CGC ATG TGA AC-3′；反向引物5′-TAG AGT CGC CAC CCT GAT GT-3′。RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參，其引物序列如下：正向引物5′-GAA GGT CGG AGT CAACGG AT-3′；反向引物5′-GAG GGA TCT CGC TCC TGG AAG-3′。PCR條件如下：預(yù)變性95 ℃ 1 min；變性95 ℃ 15 s，退火60 ℃ 15 s，延伸72 ℃ 20 s，循環(huán)45次。熒光數(shù)據(jù)用Opticon Monitor軟件進(jìn)行分析。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)肺癌組織及癌旁組織中HSF2、IL-10的表達(dá)(200×)

1.2.3Western blot檢測(cè)蛋白質(zhì) 肺癌及癌旁組織在勻漿后用RIPA裂解液進(jìn)行裂解，裂解液中包含蛋白酶抑制劑。取50 μg蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)電泳，電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。電泳條件為80 V 15～20 min，待樣品進(jìn)入分離膠后120 V電泳40～60 min。電轉(zhuǎn)移條件為200 mA 1 h。轉(zhuǎn)移后的PVDF膜用3%牛血清白蛋白封閉1 h，一抗(1∶1 000)室溫孵育過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗孵育1 h，洗滌顯影。

1.2.4免疫組織化學(xué)檢測(cè)組織蛋白質(zhì) 病理標(biāo)本取材后，經(jīng)10%中性甲醛固定、組織脫水、二甲苯透明、石蠟包埋切片，接著進(jìn)行HE染色和免疫組織化學(xué)染色，標(biāo)志物為HSF2和IL-10，光學(xué)顯微鏡下觀察免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果?？贵w表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色顆粒者為陽性細(xì)胞。每例切片陽性細(xì)胞數(shù)占同類細(xì)胞數(shù)的10%以上者視為陽性，于200×鏡下拍照。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)基為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。將細(xì)胞培養(yǎng)于含有5% CO2的37 °C培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞成對(duì)數(shù)期生長時(shí)轉(zhuǎn)移于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)約2×105個(gè)，細(xì)胞生長至60%～80%視野時(shí)，開始轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。以Lipofectamine 2000為載體，具體操作步驟按照Invitrogen公司提供的實(shí)驗(yàn)方案。

2 結(jié) 果

2.1HSF2在肺癌組織中表達(dá)上調(diào) 比較50例肺癌組織和其癌旁組織，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中HSF2 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織，占比為76%(38/50)(P<0.01)。Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中HSF2蛋白水平也明顯上調(diào)，蛋白水平和mRNA水平一致，見圖1、2。

2.2IL-10在肺癌組織中表達(dá)上調(diào) 比較50例肺癌組織和其癌旁組織，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中IL-10 mRNA的表達(dá)明顯高于癌旁組織，占比為80%(40/50)(P<0.01)。Western blot和免疫組織化學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，癌組織中IL-10蛋白水平也明顯上調(diào)，蛋白水平和mRNA水平一致，見圖1、3。

A：RT-PCR檢測(cè)HSF2的mRNA水平；B:Western blot檢測(cè)HSF2的蛋白水平

圖2肺癌組織及癌旁組織中HSF2的表達(dá)

A：RT-PCR檢測(cè)IL-10的mRNA水平；B：Western blot檢測(cè)IL-10的蛋白水平

圖3肺癌組織及癌旁組織中IL-10的表達(dá)

2.4肺癌組織中IL-10的表達(dá)上調(diào)與HSF2的表達(dá)上調(diào)呈正相關(guān) 對(duì)肺癌組織的IL-10與HSF2的表達(dá)進(jìn)行相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)IL-10的表達(dá)上調(diào)和HSF2的表達(dá)上調(diào)呈線性正相關(guān)(R2=0.9216)，見圖4。

圖4 肺癌組織中HSF2與 IL-10表達(dá)的相關(guān)分析

2.5siRNA干擾HSF2降低A549 中IL-10表達(dá) 在A549細(xì)胞中，以siRNA干擾HSF2的表達(dá)，Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，A549表達(dá)siRNA后，HSF2和IL-10的表達(dá)均明顯降低，見圖5。

圖5 siRNA干擾HSF2后IL-10的表達(dá)

3 討 論

肺癌對(duì)人類健康危害極大，細(xì)胞微環(huán)境的改變可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[7]。在細(xì)胞微環(huán)境的改變中，熱休克反應(yīng)是以基因表達(dá)變化為特征的一種防御適應(yīng)反應(yīng)，研究表明，HSF在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。本研究發(fā)現(xiàn)HSF2在肺癌組織中高表達(dá)，表明HSF2與肺癌的發(fā)生有關(guān)。HSF2被認(rèn)為主要與機(jī)體的發(fā)育有關(guān)，近年來的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤的發(fā)生和胚胎發(fā)育的早期有著非常多的相似性[8]，因此，肺癌中HSF2的表達(dá)上調(diào)也就顯得較合理。

在腫瘤的發(fā)生過程中，另一個(gè)微環(huán)境的改變就是促炎性和抗炎性細(xì)胞因子比例的改變。IL-10作為一種抗炎性細(xì)胞因子，在腫瘤的發(fā)病中具有重要作用，既可直接影響腫瘤細(xì)胞和間接抑制免疫細(xì)胞而有利于腫瘤生長，還可通過抑制腫瘤定居的巨噬細(xì)胞來抑制血管生成。在哺乳動(dòng)物體內(nèi)，IL-10和自身受體結(jié)合可以磷酸化Janus激酶1(JAK1)和酪氨酸激酶2(TYK2)，進(jìn)而激活信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)?；罨腟TAT3通過激活淋巴細(xì)胞活化信號(hào)分子(SLAM)、小異源二聚體基因1(SHP-1)和細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白3(SOCS3)等介導(dǎo)IL-10的生物學(xué)功能[9-10]。IL-10可以抑制輔助性T細(xì)胞1(Th1)細(xì)胞的生成和增殖，還可以抑制巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK細(xì)胞)的功能，使腫瘤得以逃逸而進(jìn)一步發(fā)展。隨著腫瘤發(fā)展，IL-10的水平又會(huì)進(jìn)一步升高。

研究發(fā)現(xiàn)血清IL-10的表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生成正相關(guān)，血清IL-10的水平可預(yù)示肺癌的預(yù)后[11]，也可為腫瘤的復(fù)發(fā)提供依據(jù)[12]。當(dāng)非小細(xì)胞肺癌患者的腫瘤切除后，血清IL-10水平會(huì)降低，認(rèn)為肺癌組織本身可能促進(jìn)了IL-10的生成，從而有利于腫瘤躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視，繼而使腫瘤易于發(fā)展及轉(zhuǎn)移[13]。梁晶[14]研究發(fā)現(xiàn)IL-10參與肺癌患者微環(huán)境的構(gòu)成，是導(dǎo)致肺癌免疫功能抑制的原因之一，可作為監(jiān)控晚期肺癌患者免疫功能的參考指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中IL-10高表達(dá)，進(jìn)一步說明肺癌組織可以促進(jìn)IL-10的生成。因此，在肺癌患者中進(jìn)行IL-10的監(jiān)測(cè)，可間接掌握肺癌患者的病情，便于及時(shí)調(diào)整治療方案，IL-10的水平可作為肺癌病情嚴(yán)重性的生物標(biāo)志物。

夏蜀嫻等[15]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者中HSF2的表達(dá)水平增加，HSF2可通過調(diào)控核因子-KB(NF-kB)和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)中的家族成員，參與炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，而多種炎性細(xì)胞因子又可激活NF-kB、MAPK通路，其之間關(guān)系較緊密。本研究對(duì)50例肺癌組織的HSF2和IL-10的表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)呈正相關(guān)，siRNA干擾HSF2可以降低A549 中IL-10的表達(dá)，進(jìn)一步說明HSF2可以調(diào)節(jié)肺癌細(xì)胞IL-10的表達(dá)。HSF2促進(jìn)IL-10的表達(dá)，可能有利于肺癌細(xì)胞躲避機(jī)體的免疫監(jiān)視，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤的發(fā)生，但相關(guān)分子機(jī)制還有待深入研究。

綜上所述，HSF2和IL-10在肺癌組織中表達(dá)上調(diào)，HSF2可促進(jìn)IL-10的表達(dá)，可能有促于肺癌的發(fā)生、發(fā)展，而肺癌中HSF2是否可以直接結(jié)合到IL-10的啟動(dòng)子區(qū)域調(diào)控其表達(dá)還有待進(jìn)一步的研究來揭示。

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