溫志新，孟楠，李學軍，都興范，馬淑慧，米銳，孫永欣，李樹英，李亞潔

（遼寧省農(nóng)業(yè)科學院大連生物技術研究所，遼寧大連116024）

蛹蟲草（Cordyceps militaris），又名北冬蟲夏草，北蟲草，是1種蟲菌結合的藥用兼食用真菌，與冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）同屬異種，具有極高的營養(yǎng)價值和藥用價值，隨著冬蟲夏草數(shù)量日趨減少，蛹蟲草越來越受到人們的認可[1-2]，近年來，蛹蟲草人工栽培已經(jīng)實現(xiàn)工業(yè)化，但由于生產(chǎn)中菌種不穩(wěn)定，長期冷藏菌種衰老、退化，從而影響蛹蟲草規(guī)?；a(chǎn)[3]。目前，針對蛹蟲草菌種退化問題，通常采用組織分離法、孢子分離法和蟲體回接法對菌種進行復壯[4-8]，其中蟲體回接法被認為是1種有效的菌種復壯方式，許多研究表明，蟲體回接可以使蟲生真菌對昆蟲的毒力得到回復，原有的生物學性狀也得以穩(wěn)定[9]。本文以活體柞蠶蛹培育蛹蟲草，選擇不同生長發(fā)育時期的樣品進行組織分離，研究蟲體復壯對母種質(zhì)量的影響，為規(guī)?；a(chǎn)提供性狀穩(wěn)定的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：北蟲草冰峪2號，由本實驗室提供。主要試劑：葡萄糖、蛋白胨、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B等（均為分析純）。

培養(yǎng)原料：柞蠶蛹購于遼寧省蠶業(yè)科學研究所，小麥（市售）。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基制備

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、蔗糖2%、牛肉膏1%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、瓊脂2%。采用180 mm×18 mm的試管分裝培養(yǎng)基，每支試管10 mL，加蓋棉塞，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min，完成后取出擺斜面，冷卻，無菌檢驗后待用。培養(yǎng)基高壓滅菌后冷卻到45℃，傾入直徑6.5 cm無菌平皿中，冷卻，無菌檢驗后待用。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、蔗糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、蛋白胨1%，分裝500 mL三角瓶中（150 mL），加蓋棉塞，高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌30 min，冷卻，無菌檢驗后待用。

小麥培養(yǎng)基：小麥粒25 g，料液比1∶1.5，裝于500 mL罐頭瓶。營養(yǎng)液配方：葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%，用自來水配制。高壓滅菌鍋內(nèi)121℃滅菌1 h，冷卻待用。

柞蠶蛹準備：選取健康柞蠶滯育蛹，用75%乙醇迅速擦洗蠶蛹體表。尤其是節(jié)間膜處（或?qū)⑿Q蛹用75%乙醇浸泡2 min），再用無菌水洗去殘留酒精，放在無菌托盤中晾干備用。

1.2.2 液體菌種制作

將試管母種接入上述液體培養(yǎng)基中，24℃恒溫靜止培養(yǎng)2 d后，再振蕩培養(yǎng)5 d～7 d，4層紗布過濾。備用。

1.2.3 柞蠶蛹接種培養(yǎng)

取上述菌液注射于蠶蛹，每只蠶蛹注射量0.2 mL～0.4 mL，然后把接種后的柞蠶蛹放在消過毒的塑料盒中，送入培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)至子實體成熟[10]。

1.2.4 組織分離培養(yǎng)

分別選取僵蛹（S1）、子實體初期（子實體＜1 cm，S2）、子實體早期（1 cm＜子實體＜3 cm，S3）、子實體中期（子實體≈5 cm，S4）、子實體成熟期（子實體＞7 cm，S5）的生長發(fā)育良好且未被污染的蟲草組織。具體操作：僵蛹（S1）選取接種15 d后僵化的蠶蛹，無菌條件下切開蛹體，接種針挑取內(nèi)部長滿菌絲的組織塊，接入平板培養(yǎng)基中央，適宜溫度下培養(yǎng)；子實體生長時期按生長時間與長度選取蛹蟲草形態(tài)良好并生長健壯的子實體，以子實體中上部為目標組織塊，無菌水清洗3次～5次，無菌條件下切成長1 mm的小塊，接入平板培養(yǎng)基中央，適宜溫度下培養(yǎng)。每天觀察記錄組織塊在培養(yǎng)基上的萌發(fā)和菌絲生長情況。

1.2.5 小麥培養(yǎng)基出草培養(yǎng)

待上述菌塊萌發(fā)后，轉(zhuǎn)入上述試管斜面培養(yǎng)基上，將得到的菌種分別接種于液體培養(yǎng)基中，約5 d～6 d后，將液體菌種接種于小麥培養(yǎng)基中，每個菌株各接種20個罐頭瓶。相同條件下培養(yǎng)，待子實體成熟時采收，分別記錄子實體平均長度、產(chǎn)量并測定生物轉(zhuǎn)化率。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用“平均值±標準差”表示，采用SPSS17.0軟件對試驗結果進行單因子顯著性檢驗，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同生長時期分離母種平板培養(yǎng)基上菌絲生長情況

平板培養(yǎng)基上不同生長時期分離的蛹蟲草母種菌絲生長和轉(zhuǎn)色情況見表1。

表1 不同生長時期分離的蛹蟲草母種菌絲生長和轉(zhuǎn)色情況比較Tab.1 Comparison of hypha growth and changing color of Cordyceps militaris in different treatments

從菌絲生長勢方面看，S2、S3和S4間沒有差別，菌絲長勢好，健壯，整齊，濃密且轉(zhuǎn)色快，S1和S5菌絲長勢較好，濃密但邊緣不整齊，轉(zhuǎn)色稍慢；從菌絲生長速度方面看，S3生長最快，日均生長速度為3.75 mm·d-1，其次是S2和S4，最慢是S5。多重比較表明，S2、S3，與S4分離的母種菌絲日均生長速度相比差異不顯著，但都與S1、S5兩個生長期的生長速度差異顯著，由此可知，經(jīng)蟲體回接法獲得的子實體早期（S3）分離得到母種菌絲體生長速度最快，長勢最好，為母種組織分離的最佳時期，其次為子實體初期（S2）。

2.2 不同生長期分離母種繼代培養(yǎng)對子實體產(chǎn)量影響

子實體采收均統(tǒng)一設定為接種小麥培養(yǎng)基后培養(yǎng)第40 d采收，經(jīng)繼代培養(yǎng)得到的蟲草子實體指標參數(shù)見表2。

表2 分離母種繼代培養(yǎng)子實體的生長性狀調(diào)查Tab.2 Growth status of fruiting body from subculture isolated from mother spawn

由表2可知，從子實體長度方面看，S3最長，但各生長期分離的菌種繼代間差異不顯著；從每瓶子實體鮮重與生物轉(zhuǎn)化率方面來看，S5明顯低于其他各生長期，差異達到顯著水平，S3表現(xiàn)最好，其次是S2。說明蟲體復壯分離除了子實體成熟期（S5）以外，其他各生長期分離母種繼代培養(yǎng)子實體生長性狀均表現(xiàn)良好，而S3為最適合的時期。

3 結論與討論

本研究利用活體柞蠶蛹復壯蛹蟲草菌種，試驗結果表明，選取不同生長發(fā)育時期的蛹蟲草組織分離母種，無論是菌絲生長勢還是繼代培養(yǎng)子實體的生長性狀，S3均表現(xiàn)最佳，即經(jīng)蟲體復壯獲得的子實體早期（S3）為最適合的母種組織分離時期，其后依次是子實體初期（S2）、子實體中期（S4）和僵蛹期（S1），最差是子實體成熟期（S5），可能由于成熟期細胞老化活力下降而導致分離的母種菌絲長勢及繼代培養(yǎng)子實體生長效果差[11]，因此，不適合在這個時期進行組織分離母種。王殿振等[12]采用孢子分離、組織分離、活體蠶蛹、基內(nèi)菌絲分離、蠶蛹回接等5種菌種復壯法，其中活體蠶蛹復壯法是當子實體長到2 cm～3 cm時做組織分離，而蠶蛹回接采用僵蛹組織塊，試驗確定活體蠶蛹復壯法是5種方法中最好的菌種復壯法，與本研究結果基本一致。蛹蟲草菌種退化是普遍存在的問題，菌種退化的具體機理目前還不清楚。李美娜等[13]用PCR-RFLP和RAPD方法證實退化菌株較野生馴化菌株在DNA水平上發(fā)生了頻率較高的突變，這些變異既可能發(fā)生在核基因組，也可能發(fā)生在線粒體基因組。魏靜[14]以蛹蟲草同核體菌株中克隆得到2種交配型基因，發(fā)現(xiàn)退化菌株只含有其中的1種類型交配型基因。因此，下一步要從遺傳物質(zhì)DNA著手，尋找更好地解決蛹蟲草菌種退化問題的辦法，為生產(chǎn)實踐提供參考。

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