李鑫楠 王 潔 李 濤 劉慧娟 徐 明 董福生

齲病是多種因素引起的不可逆性疾病，導(dǎo)致齲病病因包括細(xì)菌及菌斑、食物、宿主及口腔環(huán)境等[1]。人類口腔是一個復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境，細(xì)菌、飲食、遺傳等共同維持著口腔健康的動態(tài)平衡，口腔中一種或多種因素改變時，這種平衡被打破，齲病就會發(fā)生[2]。細(xì)菌是打破這種平衡的主要因素，因此，齲病被認(rèn)為是由細(xì)菌引起的一種感染性疾病[3]。目前已公認(rèn)變異鏈球菌是口腔主要的致齲菌之一[4]。

關(guān)于變異鏈球菌相關(guān)致齲機(jī)制的研究，多數(shù)集中在細(xì)菌的染色性、菌落形態(tài)、生化特性、代謝產(chǎn)物以及對菌斑生物膜影響的分析上。罕有分子水平上的研究。但細(xì)菌在不同環(huán)境中生存導(dǎo)致基因突變，產(chǎn)生不同的基因類型?；蛲蛔儗?xì)菌的生長特別是細(xì)菌的毒力造成一定的影響[5]。故基因突變是引起致齲菌致齲毒力改變的重要原因。目前，根據(jù)基因突變率判斷變異鏈球菌致齲能力的研究未見報道。

本研究接受了于2015年7月～2016年2月期間，在河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院接受窩溝封閉治療的石家莊市8～12歲學(xué)齡兒童，進(jìn)行齲病的問卷調(diào)查，分析學(xué)齡兒童睡前零食與刷牙情況對齲病的影響。設(shè)計(jì)變異鏈球菌的特異性引物，提取學(xué)齡兒童的口腔牙菌斑進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR陽性的變異鏈球菌進(jìn)行核酸序列分析。確定變異鏈球菌在分子水平和基因位點(diǎn)上的突變，確定其突變率及致齲能力，探討兒童齲病發(fā)生與致齲菌基因突變的關(guān)系。

資料和方法

一、臨床資料

本研究選取2015年7月～2016年2月期間，在河北醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院接受窩溝封閉治療的石家莊市（外國語學(xué)校、師大附小、十里鋪小學(xué)、方北小學(xué)）8歲～12歲學(xué)齡兒童。調(diào)查對象共60名兒童，分為齲病組30例，無齲組30例。采用問卷調(diào)查，收集齲病發(fā)病的臨床資料。

按照WHO口腔健康標(biāo)準(zhǔn)，采集口腔牙菌斑樣本。由口腔專業(yè)醫(yī)師按照全國口腔流行病學(xué)調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)對60名兒童進(jìn)行口腔檢查。兒童納入標(biāo)準(zhǔn)，齲病組為除齲病外無其他口腔疾病，無家族遺傳疾病，無系統(tǒng)性疾病，無長期服藥史，近3個月無抗生素服用史。無齲組為無充填體，無齲壞征象的完整牙（齲洞形成前階段及其它類似早期齲的情況，診斷不可靠，不作為齲病納入）。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.臨床資料的收集：進(jìn)行口腔檢查的同時，對60名學(xué)齡兒童進(jìn)行臨床資料的收集，針對其日常生活中零食攝入情況和刷牙情況進(jìn)行問卷調(diào)查，同時記錄檢查結(jié)果。

2.牙菌斑的收集：接受檢查的學(xué)齡兒童用0.9%的生理鹽水漱口。隔濕后用消毒的刮匙刮取牙體表面的牙菌斑，并將其置于含1.5ml TE緩沖液的凍存管中，標(biāo)號。液氮罐中速凍后于-20℃冰箱中凍存。

3、細(xì)菌總DNA的提?。喝龃娴难谰邩?biāo)本解凍，離心，7500rpm 10min，棄上清。加入180μl溶菌酶裂解液，37℃溫育30min。加入25μl蛋白酶K和200μl buffer AL，震蕩混勻。56℃溫育30min，加入200μl無水乙醇，震蕩混勻。將混合液移至帶有吸附柱的采集管中，離心，8000rpm 1min，棄采集管。將吸附柱置于新的采集管中，加入500μl buffer AW1，8000rpm離心1min，棄采集管；將吸附柱置于新的采集管中，加入500μl buffer AW2，14000rpm離心3min，棄采集管。將吸附柱置于干凈的1.5ml的離心管中，在吸附膜上直接加入100μl buffer AE，室溫放置1min，8000rpm洗滌2min。重復(fù)洗滌一次，將提取的DNA樣本于-20℃的冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

4.變異鏈球菌的PCR擴(kuò)增：Primer 5.0軟件以及BLAST設(shè)計(jì)變異鏈球菌的特異性引物：F：5ˊ-AGC GTT GTC CGG ATT TAT TGG-3ˊ；R：5 ˊ-AGA GCA CAC TAT GGT TGA GCC A-3ˊ，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：Taq pcr Maste Mix（12.5μl），10μm 正反向引物（各 1μl），DNA 模板（5μl），用無菌雙蒸水補(bǔ)充至總體積 25 μl。PCR反應(yīng)條件：initial denaturation（94℃，4min），denaturation（94℃，40s），annealing （55℃，30s），extension （72℃，30s），final extension（72℃，7min）。

5.瓊脂糖凝膠電泳：2%的瓊脂糖加熱至澄清、透明。冷卻至50℃時取25ml加入2ml EB。將加入EB的瓊脂糖倒入凝膠盤中，凝固后拔除梳齒。將凝膠盤放入電泳槽內(nèi)，加足量1×TBE緩沖液。取5μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1μl上樣緩沖液混合后加入加樣孔。接通電源，調(diào)電壓至60V，當(dāng)染料距膠沿1～2cm處，停止電泳。紫外燈下觀察，記錄電泳結(jié)果。

6.核酸序列測定：測序過程由上海生工生物工程測序部協(xié)助完成。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用卡方檢驗(yàn)檢測變異鏈球菌菌屬，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用秩和檢驗(yàn)檢測齲病組與無齲組變異鏈球菌的突變率，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、問卷調(diào)查結(jié)果

問卷調(diào)查顯示，齲病組與無齲組60名學(xué)齡兒童在睡前飲料、睡前甜點(diǎn)以及早晚刷牙的問題上，差異無顯著性（圖1）。

圖1 齲病組與無齲組的臨床問卷調(diào)查結(jié)果

二、PCR擴(kuò)增結(jié)果

所有樣本PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，均顯示出一條清晰的條帶，長度102bp。其中齲病組變異鏈球菌陽性結(jié)果21例（圖2、圖3），陽性檢出率70%；無齲組變異鏈球菌陽性結(jié)果10例（圖4），陽性檢出率33.3%。

對60名學(xué)齡兒童的變異鏈球菌檢出數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示齲病組與無齲組差別有顯著性，P＜0.05。研究結(jié)果表明，變異鏈球菌是學(xué)齡兒童齲病發(fā)生的主要致齲菌（表1）。

圖2 齲病組變異鏈球菌的PCR擴(kuò)增

圖3 齲病組變異鏈球菌的PCR擴(kuò)增

圖4 無齲組變異鏈球菌的PCR擴(kuò)增

表1 齲病組與無齲組變異鏈球菌檢出率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

三、變異鏈球菌細(xì)菌突變類型的核酸序列測定

齲病組與無齲組變異鏈球菌陽性檢出病例的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過核酸序列測定，31例陽性檢出病例中變異鏈球菌出現(xiàn)多種基因突變類型，齲病組變異鏈球菌突變率達(dá)12.7%～31.3%，平均21.3%。無齲組變異鏈球菌突變率達(dá)32.3%～39.2%，平均36.1%。個別病例變異鏈球菌基因突變涉及40個堿基。表明變異鏈球菌存在多種基因突變類型（圖5～6）。

對31例變異鏈球菌陽性檢出病例中變異鏈球菌的突變率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示齲病組與無齲組變異鏈球菌突變率差異有顯著性（P＜0.05）。無齲組變異鏈球菌的突變率高于齲病組變異鏈球菌的突變率（表2）。當(dāng)變異鏈球菌的突變率達(dá)到36.14%及以上時，直接影響了變異鏈球菌的致齲能力。

圖5 齲病組病例5：變異鏈球菌突變率12.7%

圖6 無齲組病例007：變異鏈球菌突變率39.2%

表2 齲病組與無齲組變異鏈球菌突變率的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

討 論

齲病是細(xì)菌引起的一種感染性疾病，也是口腔頜面部的常見病和多發(fā)病[6]。口腔致齲菌通過形成牙菌斑，貼附在牙體表面，破壞牙體組織。牙菌斑是由口腔微生物細(xì)胞與胞外多糖組成的復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)，是一種典型的細(xì)菌性生物膜，所以牙菌斑是致齲菌的聚集地。它是細(xì)菌在牙面上代謝和致病的生態(tài)環(huán)境，是齲病發(fā)生的始動因子。牙菌斑的致齲作用與致齲菌的代謝活動有關(guān)。牙菌斑內(nèi)的細(xì)菌之間存在相互凝集、營養(yǎng)、競爭、拮抗及新陳代謝的互利共生關(guān)系。牙菌斑形成早期，各菌屬間處于動態(tài)平衡階段，抵御外來細(xì)菌的侵入，共同維護(hù)宿主。一旦菌屬間的動態(tài)平衡被打亂，細(xì)菌之間的相互作用發(fā)生變化，齲病就會發(fā)生[7]。

變異鏈球菌被證實(shí)是口腔主要致齲菌。變異鏈球菌在牙菌斑中充分發(fā)揮其產(chǎn)酸性，耐酸性和合成胞內(nèi)外多糖的特性，導(dǎo)致齲病的發(fā)生[8]。變異鏈球菌對牙齒有很高的親和力，其對牙齒的選擇性黏附與致齲性密切相關(guān)，對牙齒表面的黏附作用使得牙齒齲患增加。研究表明牙菌斑中更容易收集到導(dǎo)致齲病發(fā)生的變異鏈球菌[9]。因此，本研究取樣部位采取了沒有齲損的頰舌側(cè)釉質(zhì)表面的牙菌斑，以保證獲取有效的樣本量。

兒童也是齲病的好發(fā)人群，由于兒童與成年人的生活習(xí)慣存在很大的差別，本項(xiàng)研究設(shè)計(jì)了問卷調(diào)查，以了解兒童的生活習(xí)慣與齲病發(fā)生的關(guān)系。在對60名學(xué)齡兒童的問卷調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，齲病組與無齲組學(xué)齡兒童普遍存在睡前飲料和睡前甜點(diǎn)的現(xiàn)象。但齲病組與無齲組學(xué)齡兒童睡前飲料和睡前甜點(diǎn)對齲病的發(fā)生，差別無顯著性。問卷調(diào)查的另一項(xiàng)是關(guān)于刷牙情況的調(diào)查，結(jié)果顯示被調(diào)查的學(xué)齡兒童均養(yǎng)成了刷牙習(xí)慣。問卷調(diào)查結(jié)果表明齲病的發(fā)生雖然是多因素引起的，但細(xì)菌仍是關(guān)鍵的致病因素[10，11]?？赡苡捎跓o齲組學(xué)齡兒童口腔內(nèi)致齲菌的致齲能力較弱，不足以導(dǎo)致齲病的發(fā)生。針對齲病組兒童晚刷牙者多于無齲組兒童的現(xiàn)象，不排除齲病組兒童刷牙方式不正確或刷牙時間不充足的問題。提示應(yīng)該加強(qiáng)學(xué)齡兒童的正確刷牙方式的教育。

齲病的致病因素包括細(xì)菌，食物，宿主及時間。臨床及生活中常?？梢姳┞队诟咧慢x風(fēng)險因素中的人群，其患齲率較低；而較少暴露于致齲因素的人群，其患齲率卻很高。提示齲病風(fēng)險的評估存在局限性，可能忽略了個體遺傳及致齲菌基因突變對齲病的影響。本次研究中，兒童飲食習(xí)慣及刷牙情況對齲病的發(fā)生無顯著性差別，故影響齲病致病的因素可能是宿主本身與細(xì)菌。動物實(shí)驗(yàn)和流行病學(xué)調(diào)查研究證明，遺傳因素對齲病的發(fā)生有關(guān)[12]?；谝陨侠碚?，我們提出細(xì)菌的基因突變類型不同，導(dǎo)致致齲能力存在差異的設(shè)想。

PCR技術(shù)具有高度特異性和高度敏感性，對于變異鏈球菌的鑒定具有獨(dú)特的優(yōu)勢[13]，通過設(shè)計(jì)變異鏈球菌的特異性引物，經(jīng)變異鏈球菌PCR證實(shí)60例學(xué)齡兒童樣本中，31例含有變異鏈球菌，其中齲病組21例，無齲組10例。齲病組除21例陽性病例外，存在9例陰性病例。有研究表明，兒童齲病致病菌除變異鏈球菌外，還發(fā)現(xiàn)乳桿菌與內(nèi)氏放線菌也是兒童齲病發(fā)生的致病菌[14，15]。齲病組中有9例變異鏈球菌陰性的病例，可能由個體遺傳及其他致齲菌導(dǎo)致，如乳桿菌、內(nèi)氏放線菌等。無齲組30名學(xué)齡兒童中，變異鏈球菌檢出10例，但未發(fā)生齲病。核酸序列測定分析發(fā)現(xiàn)，這些變異鏈球菌存在極大的基因突變。這種基因突變可能導(dǎo)致細(xì)菌的致齲力下降，即使感染，并未致齲。雖然這些兒童口腔內(nèi)變異鏈球菌致齲能力較弱，但仍存在潛在的齲病發(fā)病風(fēng)險[16]，應(yīng)定期隨訪檢查，密切關(guān)注齲病的發(fā)生。

國內(nèi)同行的研究多數(shù)集中在致齲菌的染色性、菌落形態(tài)、生化特性和代謝產(chǎn)物以及對菌斑生物膜的影響上[17～21]，罕有涉及細(xì)菌不同基因類型致齲能力的研究。變異鏈球菌核酸測序結(jié)果顯示，變異鏈球菌存在多基因突變類型。本研究將齲病組與無齲組擴(kuò)增出的31例變異鏈球菌陽性病例與國際標(biāo)準(zhǔn)的變異鏈球菌ATCC25175菌株在基因?qū)W上進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌存在不同的基因類型，并且其突變率存在差異。核酸測序結(jié)果顯示兒童致齲菌的變異鏈球菌突變率達(dá)12.7%～39.2%。研究結(jié)果表明，導(dǎo)致兒童齲病的變異鏈球菌存在多種基因類型。變異鏈球菌不同基因類型的產(chǎn)生與遺傳及其所處的環(huán)境有關(guān)，個體口腔內(nèi)pH值的差異、氟含量以及糖含量等的差異引起口腔環(huán)境的不同[22]。此外，個體基因上的差異以及刷牙、窩溝封閉、其他預(yù)防措施的采取，也會導(dǎo)致口腔內(nèi)環(huán)境的差異[23，24]。細(xì)菌遺傳物質(zhì)的變化或者細(xì)菌受到環(huán)境因素的影響均可導(dǎo)致細(xì)菌發(fā)生變異，使子代細(xì)菌的生物性狀與宗帶不同，從而產(chǎn)生了多種基因類型。

齲病組變異鏈球菌突變率為12.7%～31.3%，無齲組變異鏈球菌突變率達(dá)32.3%～39.2%。對兩組變異鏈球菌突變率進(jìn)行分析，證實(shí)齲病組與無齲組變異鏈球菌突變率的差異有顯著性，無齲組變異鏈球菌突變率高于齲病組。結(jié)果提示突變率過高影響了變異鏈球菌的致齲能力。研究證明不同人群變異鏈球菌基因型存在差異，不同變異鏈球菌基因型的致齲能力也存在差異[25]。并且變異鏈球菌的致齲能力具有遺傳性[26]，即使同屬一個種群，不同菌株的遺傳性也存在一定的差異[27]。齲病易感性與口腔中變異鏈球菌的基因類型有關(guān)[28]?？梢哉J(rèn)為，變異鏈球菌的突變率直接影響了齲病的致齲能力。當(dāng)變異鏈球菌突變率達(dá)到或超過36.14%水平時，變異鏈球菌的致齲能力明顯下降或喪失致齲能力。此時，變異鏈球菌性質(zhì)屬于低毒力致齲菌株或非致齲菌株。

這一研究成果可應(yīng)用于臨床，在臨床防治兒童齲病時，采用核酸序列測定的方法確定齲易感兒童的感染菌，針對齲易感兒童采取有效的防治措施。

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