劉 景 袁 媛

牙髓組織是由成牙本質(zhì)細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及疏松的神經(jīng)血管結(jié)締組織組成[1，2]。其中心含有豐富的基質(zhì)細(xì)胞和牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，HDPSCs）[3]。HDPSCs具有間葉干細(xì)胞的特征，不僅與牙本質(zhì)細(xì)胞的發(fā)生有關(guān)，而且能夠促進(jìn)牙髓血管再生[4]。有研究[5]表示體外培養(yǎng)HDPSCs能夠促進(jìn)損傷牙髓血管再生，對(duì)牙髓的損傷修復(fù)具有非常重要的意義。其以獲得容易、高增值、免疫抑制、多向分化等特點(diǎn)成為臨床上常用的一種牙髓組織損傷修復(fù)的治療方法[6]。p-ERK1/2和p-p38是細(xì)胞中重要的信號(hào)傳導(dǎo)通路，當(dāng)細(xì)胞間信號(hào)加速傳遞時(shí)，可加速組織血管再生，體外培養(yǎng)HDPSCs后能誘導(dǎo)p-ERK1/2和p-p38蛋白加速表達(dá)，從而加速牙髓血管再生能力。在體外條件下牙髓組織細(xì)胞較難存活，需要較高的生存條件，有研究表明[7]，人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（human microvascular endothelial cell，HMEC）有與牙髓組織細(xì)胞相似的生理基礎(chǔ)，其血管再生能力也與牙髓血管再生性相似。因此，為了進(jìn)一步探討人HDPSCs在體外培養(yǎng)促進(jìn)血管再生的潛能及機(jī)制，本研究選取HMEC[7]隨機(jī)分成陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和HDPSCs組，通過測(cè)量每組HMEC細(xì)胞增殖、遷移情況以及p-ERK1/2和p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量揭露HDPSCs促進(jìn)牙髓血管再生的機(jī)制，現(xiàn)將報(bào)道如下。

資料和方法

1.材料及試劑

HMEC（購自上海拜力生物科技有限公司，貨號(hào)：HEK-293），胎牛血清（FBS）、DMSO 和麗春紅 s染液（購自南京森貝伽生物科技有限公司，貨號(hào)：SBJ-O0001、SBJ-1050、SBJ-0844），VEGF 抗 體 、HRP-IgG抗體、MTS增殖試劑和rip-a細(xì)胞蛋白裂解液（購自上海齊一生物科技有限公司，貨號(hào)：3489-100、6908-250、K300-2500、SH0634），PBS 和DMEM培養(yǎng)液（購自上海哈靈生物科技有限公司，貨號(hào)：HLCZ0024、HL12052.3.1），α-MEM、胰蛋白酶和TBST（購自南京科佰生物科技有限公司，貨號(hào)：SH30265.01B、T1300、524753-1EACN）。

分組：選取人微血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為陰性對(duì)照組，陽性對(duì)照組和HDPSCs組，陰性對(duì)照組采用不含胎牛血清（FBS）的α-MEM培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組加入含100ml/l FBS的α-MEM培養(yǎng)基，HDPSCs組加入HDPSCs培養(yǎng)。

2.HDPSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

取16～20歲志愿者正畸減數(shù)健康前磨牙，用超凈工作臺(tái)將前磨牙劈開取出牙髓組織，將牙髓組織剪碎后放入離心管，用十倍量的組織消化液消化1h，消化過程中不斷輕微吹打，最終在顯微鏡下看到細(xì)胞呈現(xiàn)圓形懸浮液為止。1000r/min的離心機(jī)下離心6min，棄上清液。取100ml/l胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞，不斷的輕微吹打，直到細(xì)胞充分離散。用細(xì)胞篩網(wǎng)過濾得到單個(gè)離散細(xì)胞，細(xì)胞密度為1×105/ml，37℃、50ml/l二氧化碳的條件下接種培養(yǎng)。三天更換培養(yǎng)基，棄去沒有貼壁的細(xì)胞。用濾紙轉(zhuǎn)移法挑出克隆成功的細(xì)胞，在2.5g/l的消化液中進(jìn)行消化，10min之后用1000r/min的離心機(jī)離心6min棄上清液，剩余的細(xì)胞以1:2的濃度進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第三代細(xì)胞HDPSCs用于實(shí)驗(yàn)。

鑒定：按上述方法擴(kuò)大培養(yǎng)克隆的人牙髓干細(xì)胞至約1×107/ml，胰酶消化后用PBS沖洗，加重懸細(xì)胞，再加入預(yù)冷的無水乙醇吹打混勻，過夜，離心棄乙醇，洗兩遍，染色后用目的尼龍篩網(wǎng)過濾，流式細(xì)胞儀上機(jī)，進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)。ABC法將生長(zhǎng)良好的克隆化培養(yǎng)細(xì)胞做細(xì)胞爬片進(jìn)行抗Vimitin、CD44、ON、DSP免疫細(xì)胞化學(xué)染色，顯色，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。光鏡下觀察。

3.人微血管內(nèi)皮細(xì)胞（HMEC）增殖能力觀察

HMEC培養(yǎng)于含10%FBS的α-MEM培養(yǎng)液，添加100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素雙抗，于 50ml/l CO2，37℃的條件下培養(yǎng)，2～3d 傳代 1次。用PBS將傳代后的HMEC洗滌2次后接種于96孔板。復(fù)6孔為一組，將細(xì)胞隨機(jī)分配給HDPSCs組、陽性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。各組加入實(shí)驗(yàn)設(shè)定培養(yǎng)液培養(yǎng)，于培養(yǎng)后0、12、24、48h棄原培養(yǎng)液取細(xì)胞，然后添加5mg/ml的MTS于各組孔，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，再添加150μl的DMSO后放置于搖床，震蕩20min致結(jié)晶完全溶解后對(duì)各孔570nm處的吸光值測(cè)定。為保證實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)并求平均值。

4.HMEC遷移能力觀察

通過Trans-well小室實(shí)驗(yàn)進(jìn)行測(cè)定HMEC遷移能力。將5×104/cm2的密度第3代HDPSCs細(xì)胞接種于24孔板（下室），添加100ml/l FBS的α-MEM培養(yǎng)基，37℃的條件下培養(yǎng)24h使其貼壁后，棄原培養(yǎng)液更換為不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)；培養(yǎng)HDPSCs的小室中同時(shí)插入接種有HMEC的聚碳酸酯濾膜；然后將其分為三組，HDPSCs組、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照的下室中分別加入HDPSCs、不含F(xiàn)BS的α-MEM培養(yǎng)基和含100 ml/l FBS的α-MEM培養(yǎng)基，均繼續(xù)培養(yǎng)于37℃，50ml/l CO2條件下。培養(yǎng)24h后，濾膜下表面細(xì)胞用4%PFA進(jìn)行固定，在結(jié)晶紫染色10min后PBS沖洗，鏡下對(duì)細(xì)胞計(jì)數(shù)。

5.Western blot檢測(cè) p-ERK1/2和 p-p38蛋白表達(dá)

取第三代HDPSCs細(xì)胞在ripa細(xì)胞蛋白裂解液中裂解取30ml細(xì)胞懸濁液，蛋白質(zhì)濃度采用BCA法測(cè)定后再行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電離，電泳完成后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用麗春紅s染色觀察轉(zhuǎn)膜效果。洗去麗春紅s染液用50g/l的脫脂奶粉4℃的情況下進(jìn)行蛋白封閉雜交，4℃ 50g/l脫脂奶粉封閉過夜；一抗（1:1000）室溫孵育2h后TBST沖洗三次，HRP-IgG（1:2000）溫孵育1.5h后TBST沖洗三次。最后DAB顯色，在暗室曝光。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

1.HDPSCs分離、培養(yǎng)及鑒定

采用酶消化組織塊貼壁法分離培養(yǎng)人牙髓組織，培養(yǎng)5d后組織周圍有梭形細(xì)胞爬出，似成纖維細(xì)胞，見圖1A，10d后細(xì)胞呈集落狀融合，見圖1B，利用有限稀釋法挑選細(xì)胞克隆，培養(yǎng)10d左右，使用0.25%胰酶消化克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得純化HDPSCs，見圖 1C。

2.各組HEMC增殖情況比較

陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和HDPSCs組培養(yǎng)0h和12h HEMC細(xì)胞OD值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；陽性對(duì)照組培養(yǎng)24h和48h HEMC細(xì)胞OD值明顯高于陰性對(duì)照組和HDPSCs組（P＜0.05）；HDPSCs組培養(yǎng)24h和48h HEMC細(xì)胞OD值明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），見表1。

圖1 HDPSCs分離、培養(yǎng)

圖2 各組HEMC細(xì)胞遷移圖（400，倍數(shù)） （A：陽性對(duì)照組；B：HDPSCs組；C：陰性對(duì)照組）

表1 各組HEMC細(xì)胞OD值（±s，n＝6）

表1 各組HEMC細(xì)胞OD值（±s，n＝6）

注：a與陰性對(duì)照組比較P＜0.05；b與陽性對(duì)照組比較P＜0.05

組別陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組H D P S C s組F p 4 8 h 0.3 5 2±0.0 8 8 0.6 2 4±0.1 0 3 a 0.4 5 5±0.0 9 6 ab 9.8 2 2＜0.0 5 0 h 0.3 1 2±0.0 6 1 0.3 2 0±0.0 5 7 0.3 1 8±0.0 6 8 1.0 6 7＞0.0 5 1 2 h 0.3 2 2±0.0 9 8 0.3 4 4±0.1 0 1 0.3 3 4±0.0 9 7 1.5 6 7＞0.0 5 2 4 h 0.3 3 5±0.1 0 4 0.5 1 1±0.0 9 9 a 0.3 9 0±0.0 9 8 ab 5.3 2 7＜0.0 5

3.各組HEMC細(xì)胞遷移比較

陽性對(duì)照組HEMC細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組和HDPSCs組（P＜0.05）；HDPSCs組HEMC細(xì)胞遷移數(shù)明顯多于陰性對(duì)照組（P＜0.05），見表2、圖 2。

表2 各組HEMC細(xì)胞遷移比較（±s，n＝6）

表2 各組HEMC細(xì)胞遷移比較（±s，n＝6）

注：a與陰性對(duì)照組比較P＜0.05；b與陽性對(duì)照組比較P＜0.05

組別陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組H D P S C s組遷移細(xì)胞數(shù)（個(gè)）4 5.6 4±6.8 7 1 1 5.6 4±1 2.0 6 a 7 5.6 0±9.8 1 a b F P 5 4.3 2 2＜0.0 5

4.各組 ERK1/2、p-ERK1/2、p38和 p-p38蛋白表達(dá)比較

陽性對(duì)照組 ERK1/2、p-ERK1/2、p38和 p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組和HDPSCs組（P＜0.05）；HDPSCs 組 ERK1/2、p-ERK1/2、p38 和p-p38蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照組（P＜0.05），見表 3。

表3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、p38和p-p38 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

表3 各組ERK1/2、p-ERK1/2、p38和p-p38 蛋白表達(dá)比較（±s，n＝6）

注：a與陰性對(duì)照組比較P＜0.05；b與陽性對(duì)照組比較P＜0.05

組別陰性對(duì)照組陽性對(duì)照組H D P S C s組F p E R K 1/2蛋白相對(duì)表達(dá)0.2 1 4±0.0 4 7 0.9 4 7±0.0 3 7 a 0.5 2 8±0.0 4 6 ab 1 5.2 0 1＜0.0 5 p-E R K 1/2蛋白相對(duì)表達(dá)0.1 5 4±0.0 2 6 0.8 6 7±0.0 4 3 a 0.4 2 2±0.0 5 0 ab 1 2.0 6 4＜0.0 5 p 3 8蛋白相對(duì)表達(dá)0.1 7 4±0.0 6 3 0.8 3 3±0.0 6 9 a 0.5 5 4±0.0 7 4 ab 1 4.0 3 2＜0.0 5 p-p 3 8蛋白相對(duì)表達(dá)0.1 3 4±0.0 7 0 0.7 9 2±0.0 8 6 a 0.5 1 2±0.0 7 7 ab 1 3.1 5 5＜0.0 5

討 論

牙髓損傷修復(fù)涉及復(fù)雜的生物學(xué)過程，其關(guān)鍵在于牙髓血管再生。有研究表明HDPSCs能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，具有促進(jìn)血管再生的潛能[8]。HDPSCs包括胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞，HDPSCs的發(fā)展受到各種內(nèi)部機(jī)制和微環(huán)境因素的影響，其在條件適宜的情況下可在體外培養(yǎng)成功。有研究發(fā)現(xiàn)，成人HDPSCs可以定向分化成其他類型的細(xì)胞和組織，這為HDPSCs的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。HDPSCs來源于外胚間葉多功能干細(xì)胞，可以分化為成釉細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞和牙髓成纖維細(xì)胞，并且還可重新編碼誘導(dǎo)分化其他牙髓多功能干細(xì)胞增殖分化，增殖效率比較高且容易獲得[9]。一般在脫落乳牙中分離提取得到HDPSCs，通過體外擴(kuò)增，用于自體某些組織的損傷修復(fù)[10]，排除了免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生。

有研究發(fā)現(xiàn)[11]在牙髓損傷過程中增加血液供應(yīng)可減少牙髓的損傷程度，所以牙髓損傷中牙髓和牙本質(zhì)修復(fù)的關(guān)鍵是血管再生成。正常情況下，牙髓中含有豐富血管及干細(xì)胞，當(dāng)牙髓損傷嚴(yán)重時(shí)其血液供應(yīng)不足，HDPSCs大大減少[11]。牙髓血管豐富，在受到外界刺激或者細(xì)菌侵入時(shí)，深層的未分化牙髓組織受到HDPSCs誘導(dǎo)后，能重新分化出新生牙髓血管，繼續(xù)運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)[12]。HMEC有與牙髓細(xì)胞相似的生理結(jié)構(gòu)，細(xì)胞間相互連接后能形成豐富的血管系統(tǒng)，其對(duì)環(huán)境要求不高，在室溫下給予合適的濕度和營養(yǎng)物質(zhì)即可存活。而牙髓組織較脆弱，目前僅能在人類正常牙髓腔中存活，其可代替牙髓細(xì)胞進(jìn)行體外研究實(shí)驗(yàn)[13]。因此，本研究采用HMEC進(jìn)行體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

牙髓細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)通路是一種由聯(lián)級(jí)放大反應(yīng)活化絲/蘇氨酸蛋白激酶組成，聯(lián)級(jí)反應(yīng)可放大牙髓組織電生物信號(hào)，并將其傳導(dǎo)在牙髓細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行調(diào)節(jié)，控制細(xì)胞相關(guān)的生命活動(dòng)，促進(jìn)牙髓血管再生。該通路主要由兩種蛋白組成，分別是p-ERK1/2和p-p38。有大量的研究[14]表示當(dāng)細(xì)胞過度表達(dá)p-p38上游激活因子時(shí)，能夠激活牙髓干細(xì)胞增殖遷移能力，對(duì)牙髓損傷組織修復(fù)具有非常重要的意義。p-ERK1/2信號(hào)通路是牙髓細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路當(dāng)中最經(jīng)典途徑，對(duì)細(xì)胞增殖、分化和凋亡都起著非常重要的調(diào)控作用，它能誘導(dǎo)牙髓成纖維細(xì)胞加速分化[14]，使牙髓血管加速再生。p-ERK1/2作為牙髓細(xì)胞激酶途徑中重要的激活因子，能加速HDPSCs進(jìn)行加速分化過程。當(dāng)HDPSCs在體外進(jìn)行加速誘導(dǎo)時(shí)，能同時(shí)對(duì)p-ERK1/2和p-p38蛋白進(jìn)行表達(dá)，可使牙髓細(xì)胞誘導(dǎo)至最大化加快牙髓血管再生，激活細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)HDPSCs定向分化對(duì)牙髓血管再生具有重要的意義[15]。本研究中表3顯示，HDPSCs組中p-ERK1/2和p-p38蛋白的相對(duì)表達(dá)量較高，說明應(yīng)用人牙髓干細(xì)胞能增加細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而減緩牙髓損傷，加速牙髓血流通暢。研究所得結(jié)果與葉國的相關(guān)研究成果一致[16]。

本研究中表1顯示，加入人牙髓干細(xì)胞的HDPSCs組培養(yǎng)24h和48h HEMC細(xì)胞OD值為（0.390±0.098）和（0.455±0.096），對(duì)比陰性對(duì)照組的（0.335±0.104）、（0.352±0.088）明顯上升，說明應(yīng)用人牙髓干細(xì)胞能分化出相應(yīng)牙髓細(xì)胞，從而加快牙髓血管再生反應(yīng)。表2顯示，HDPSCs組中的HEMC細(xì)胞遷移數(shù)為（75.60±9.81）個(gè)，明顯多于陰性對(duì)照組的（45.64±6.87）個(gè)，少于陽性對(duì)照組的（115.64±12.06）個(gè)，圖2也很直觀的顯示出HDPSCs組的HEMC細(xì)胞個(gè)數(shù)逐漸增多，說明應(yīng)用人牙髓干細(xì)胞能起到對(duì)牙髓細(xì)胞加速增殖分化，并能加快遷移至牙髓表層，加快牙髓血管網(wǎng)的構(gòu)建。以上研究結(jié)果也與馮毅等學(xué)者的相關(guān)研究成果一致[17]。

本研究的創(chuàng)新之處在于，分析多項(xiàng)指標(biāo)與牙髓血管再生及損傷修復(fù)的相關(guān)性使結(jié)果更加客觀，為HDPSCs在體外促進(jìn)血管再生的機(jī)制提供了更深入的研究思路，為牙髓損傷修復(fù)提供了更安全有效的治療方法。

綜上所述，HDPSCs在在體外可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，可能與其參與ERK1/2和p-38 MAPK信號(hào)通路有關(guān)。

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