姚天華 李全雁 李立峰 杜婧婷 Krishna Regmi葛蘇蒙 屠軍波

血管瘤是一種由血管內(nèi)皮細(xì)胞異常增殖所形成的良性腫瘤，臨床上，曾使用激光、干擾素、血管栓塞以及外科手術(shù)等方法來治療血管瘤，但是，這些治療只是抑制了血管內(nèi)皮細(xì)胞的過度增殖，而促使血管瘤收縮的作用并不是很理想。2008年法國醫(yī)生Léauté-Labrèze偶然發(fā)現(xiàn)口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤有不錯(cuò)的療效后[1]，很多學(xué)者對此進(jìn)行了研究，充分肯定了這種非選擇性β受體阻滯劑在嬰幼兒血管瘤上的療效[2～5]。JiYi等學(xué)者，用 100umol/L 普萘洛爾處理血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞誘發(fā)凋亡時(shí)[6]，檢測到caspase3、caspase9、bax等表達(dá)上調(diào)；我們運(yùn)用生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)這些相關(guān)的基因都位于P53凋亡通路的下游，這是否提示了我們P53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了普萘洛爾誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，而MDM2被認(rèn)為是最重要的P53調(diào)節(jié)蛋白[7]，能使細(xì)胞內(nèi)的P53維持在一個(gè)較低的水平[8～10]。在本實(shí)驗(yàn)中，我們將對普萘洛爾誘導(dǎo)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡機(jī)制進(jìn)行研究，初步研究P53、MDM2與普萘洛爾誘導(dǎo)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)系，為血管瘤的治療提供新的思路和靶點(diǎn)。

資料和方法

一、細(xì)胞來源及分組

離體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞是人增殖期血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞（西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院惠贈）。經(jīng)培養(yǎng)、鑒定后，隨機(jī)分為普萘洛爾組和空白對照組；普萘洛爾組調(diào)整藥物濃度為100umol/L；空白對照組不給特殊處理。

二、形態(tài)學(xué)觀察

1.倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：將處于對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2×105/ml個(gè)細(xì)胞，在倒置顯微鏡下，連續(xù)動態(tài)觀察24小時(shí)，記錄兩組細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的變化。

2.透射電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變：將處理24h后的細(xì)胞消化，放于10ml離心管中離心，棄上清液，電鏡固定液固定，透射電鏡觀察記錄（日本日立H-600）。

3.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率：將處理24h后的細(xì)胞消化，10ml離心管離心，棄上清液，PBS（4℃）清洗沉淀的細(xì)胞兩次，250μl結(jié)合緩沖液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/ml，100μl離體細(xì)胞懸液溶于5ml的流式管中，加入 Annexin V-FITC（5μl）和碘化丙錠溶液（10μl 20μg/ml）混均，室溫下避光孵育（15min），反應(yīng)管中加入400μl PBS，分析并記錄數(shù)據(jù)。

4.PCR檢測TP53與MDM2表達(dá)：①引物序列：首先NCBI數(shù)據(jù)庫，查閱各檢測基因，PRIMER5.0引物設(shè)計(jì)軟件，進(jìn)行設(shè)計(jì)，委托北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)限公司合成引物。②收集24h時(shí)兩組細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書，依次進(jìn)行細(xì)胞總RNA提取，DNase處理（選用）去除RNA樣品中殘留DNA，逆轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR，RT-PCR產(chǎn)物特異性檢測。

5.Western blot鑒定凋亡關(guān)鍵蛋白P53和MDM2的表達(dá)：收集24h時(shí)兩組細(xì)胞，根據(jù)試劑盒說明書，進(jìn)行Ripa蛋白裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCAkit蛋白定量，樣品煮沸變性，將10%凝膠板放入電泳槽內(nèi)，倒入1×RunningBuffer，每孔上樣30ug總蛋白，電泳，流水沖洗下，取出膠片，濕轉(zhuǎn)，用含5%脫脂奶粉的TBS室溫封閉2小時(shí)，結(jié)合一抗，4℃過夜，漂洗，結(jié)合二抗，漂洗，發(fā)光：按商品說明于暗室中操作，梯度曝光。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：每組樣本設(shè)置三個(gè)平行副孔，重復(fù)三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，將所得到相近的數(shù)據(jù)，應(yīng)用GraphPad Prism進(jìn)行分析，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，繪制柱狀圖；SPSS 13.0分析，t檢驗(yàn)組間差異；P＜0.05，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

1.倒置顯微鏡觀察結(jié)果：用100umol/L的普萘洛爾處理體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，在倒置纖維鏡下，在24小時(shí)內(nèi)，連續(xù)不斷的觀察血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上的變化；細(xì)胞如圖1，0～3h，體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的“鋪路石”狀，細(xì)胞伸展充分，邊緣銳利，細(xì)胞貼壁；8h，大部分血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)明顯的變化，小部分血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞邊緣變得圓潤，細(xì)胞貼壁良好，尚未出現(xiàn)細(xì)胞游離；到24h時(shí)，大部分細(xì)胞邊緣圓潤，呈凋亡相，如圖1。

圖1 實(shí)驗(yàn)組（100umol/L）各時(shí)間點(diǎn)倒置顯微鏡觀察結(jié)果（標(biāo)尺為161um）

2.血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的鑒定：血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有第Ⅷ凝血因子抗原的表達(dá)，在倒置顯微鏡下，經(jīng)生物素標(biāo)記抗體，DBA顯色后，可看見血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有棕黃色陽性顆粒散在分布，結(jié)合體外培養(yǎng)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征和免疫組化學(xué)檢測，證實(shí)培養(yǎng)的細(xì)胞為HEC；如圖2。

圖2 血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞第Ⅷ凝血因子抗原檢測

圖3 電鏡下，實(shí)驗(yàn)組與對照組24小時(shí)后，電鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的變化（標(biāo)尺為5um）

3.透射電鏡觀察結(jié)果：如圖3，對照組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的胞漿均一，表面有微絨毛存在。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表面微絨毛消失，染色質(zhì)邊緣化，細(xì)胞核膜、細(xì)胞膜內(nèi)陷，形成新月形致密小斑塊，胞吐出w-p小體。

二、流式細(xì)胞儀檢測凋亡率

通過流式細(xì)胞儀測量空白對照組和實(shí)驗(yàn)組血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡情況，對照組凋亡率為4.87%，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率為14.67%，兩者相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

三、RT-PCR鑒定凋亡蛋白相關(guān)基因

RT-PCR檢測P53、MDM2表達(dá)水平：實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，空白對照組相比，加藥組中的P53、MDM2出現(xiàn)高表達(dá)，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖5、6）。

四、Western blot鑒定凋亡相關(guān)蛋白

Western blot結(jié)果顯示，與空白對照相比，加藥組中的 P53、MDM2 出現(xiàn)高表達(dá)，P＜0.05（圖 7、8），具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與RT-PCR結(jié)果一致。

圖5 RT-PCR檢測P53的表達(dá)水平

圖6 RT-PCR檢測MDM2的表達(dá)水平

圖7 W estrnblot檢測P53蛋白表達(dá)水平

圖8 W estrn-blot檢測MDM2蛋白表達(dá)水平

討 論

2012年，Wong A[11]通過用100umol/L的普萘洛爾處理血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)血管瘤消退后，鏡下出現(xiàn)了大量脂肪纖維組織，認(rèn)為普萘洛爾通過在血管瘤內(nèi)部形成脂肪組織，進(jìn)而加速血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。JiYi等人[6]也用100umol/L的普萘洛爾干預(yù)體外培養(yǎng)的血管瘤細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生了凋亡，并發(fā)現(xiàn)VEGF下調(diào)，而caspase3、caspase9和bax呈現(xiàn)出了高表達(dá)；VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，能夠促進(jìn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞分化和增殖[12，13]；許多學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)在血管瘤增殖期時(shí)，VEGF呈高表達(dá)，并且用糖皮質(zhì)激素治療血管瘤時(shí)，發(fā)現(xiàn)VEGF下調(diào)[12]，說明普萘洛爾可能對血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖造成了影響。在我們的前期實(shí)驗(yàn)[14]中，用50ug/ml的普萘洛爾處理離體血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞，通過基因芯片技術(shù)，發(fā)現(xiàn)有 caspase3、caspase8、Cyt-c、AIF、PARP1、laminB1等蛋白呈現(xiàn)高表達(dá)；caspase家族、Cyt-c、bax等蛋白是與細(xì)胞凋亡發(fā)生的高度相關(guān)的凋亡蛋白。所以我們推測，普萘洛爾作用于體外培養(yǎng)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞后，使這些凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而使血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)入凋亡進(jìn)程。說明普萘洛爾作用于血管瘤的機(jī)制，可能是抑制了血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，同時(shí)，普萘洛爾也促進(jìn)了血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡。

在本次實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到隨著100umol/L普萘洛爾藥物作用的時(shí)間增加，體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)開始由緊密鋪滿壁底的“鋪路石”型，逐漸出現(xiàn)細(xì)胞變圓，小部分細(xì)胞脫壁、漂浮。處理24h后，透射電鏡下發(fā)現(xiàn)血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞胞膜內(nèi)陷、破裂，有凋亡小體和致密的新月形小斑塊。流式細(xì)胞儀測得空白對照組凋亡率4.87%，而普萘洛爾組的凋亡率為14.67%，明顯高于對照組。同時(shí)，加藥組P53和MDM2均呈現(xiàn)出明顯的高表達(dá)態(tài)勢。證明普萘洛爾確實(shí)能夠引起體外培養(yǎng)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生凋亡，并且P53和MDM2均參與該過程。

通過對P53基因的研究，夠使我們更有目的的去研究普萘洛爾誘導(dǎo)的血管瘤內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡途徑，更有目的的去檢測一些凋亡相關(guān)基因，同時(shí)，有利于我們對普萘洛爾治療血管瘤的機(jī)制的探索。同時(shí)，對P53及MDM2的研究，是否能夠給我們在醫(yī)學(xué)的其他方向帶來新的進(jìn)展或突破，如抑制P53的表達(dá)或促進(jìn)MDM2的表達(dá)，是否有利于組織再生或減輕組織移植的免疫排斥，P53靶向藥物給腫瘤患者能否帶來新的希望等，都有待于我們的進(jìn)一步深入研究。

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