李春梅，侯典朋，王丹，任璐瑤，沈思宇

（1.黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院,哈爾濱 150028；2.黑龍江東方學(xué)院食品工程，哈爾濱 150066；3.吉林大學(xué)食品加工與安全，長(zhǎng)春 130012）

0 引 言

近些年來(lái)，隨著膠原蛋白提取技術(shù)的發(fā)展，膠原蛋白越來(lái)越受到普通大眾的關(guān)注。作為生物體內(nèi)含量最多的一種蛋白質(zhì)，可以應(yīng)用到乳及乳制品、保健品、化妝品、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域，應(yīng)用范圍多樣化導(dǎo)致其有很好的發(fā)展前景。膠原蛋白是一種不透明、白色、無(wú)支鏈的纖維蛋白質(zhì)，分布在動(dòng)物全身各個(gè)組織器官，如骨骼、韌帶、皮膚、軟骨等，約占總蛋白質(zhì)的25%～35%[1-2]。膠原蛋白的氨基酸組成因來(lái)源和蛋白質(zhì)類(lèi)型不同而有所差異[3]，但大致的氨基酸組成相同,羥脯氨酸是膠原蛋白特有氨基酸，用羥脯氨酸的量乘以相對(duì)應(yīng)的換算系數(shù)就得到膠原蛋白的含量[4]。近年來(lái)，市面上的膠原蛋白產(chǎn)品琳瑯滿目，膠原蛋白在乳制品方面應(yīng)用的也很廣，乳制品中蛋白的檢測(cè)主要方法是國(guó)標(biāo)的凱氏定氮法，但是對(duì)于乳制品中膠原蛋白的檢測(cè)還未有標(biāo)準(zhǔn)，因此根據(jù)市場(chǎng)的需求研究開(kāi)發(fā)一種膠原蛋白的檢測(cè)方法是具有十分重要的意義。

1 膠原蛋白

1.1 膠原蛋白的種類(lèi)

目前已發(fā)現(xiàn)27種不同類(lèi)型的膠原蛋白,依照發(fā)現(xiàn)的先后順序采用羅馬數(shù)字命名為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型膠原蛋白等，其中含量最多的以Ⅰ型膠原蛋白為主，占全部膠原蛋白含量的90%以上[5-6]。按構(gòu)成組織可分為纖維狀膠原、軟骨質(zhì)膠原、玻璃狀膠原、彈性膠原等[7]。根據(jù)在體內(nèi)的功能和散布特點(diǎn),可將膠原蛋白分成間質(zhì)膠原、基底膜膠原、細(xì)胞外周膠原。

1.2 膠原蛋白的來(lái)源

膠原蛋白的來(lái)源很多，以前主要來(lái)源于豬、牛的皮和骨骼等。但由于瘋牛病、口蹄疫爆發(fā)，開(kāi)始采用魚(yú)的骨、鱗、皮作為制備膠原蛋白的主要原料[8-10]。人們也開(kāi)始從其他加工副產(chǎn)物中提取膠原蛋白，如Cli?che J[11]利用胃蛋白酶對(duì)雞皮進(jìn)行消化處理得到膠原蛋白，結(jié)果可以獲得純度為74.4%的Ⅰ型膠原蛋白。李小勇等人按GB9695.23-90《肉和肉制品中L(-)-羥脯氨酸含量測(cè)定》從豬肺中提取出HYP，通過(guò)轉(zhuǎn)換系數(shù)最后得出膠原蛋白含量在3.0%～3.2%之間。

1.3 膠原蛋白的應(yīng)用

膠原蛋白可用于純牛奶、酸奶、中性奶飲料等液態(tài)乳制品中，不但保持原有的各種生理功能，還對(duì)乳制品品質(zhì)有一定的改善作用[12]。在褐色乳飲料中添加膠原蛋白具有乳化穩(wěn)定、提高口感和改善風(fēng)味的作用。Riichiro O[13]在保健品中加入了膠原蛋白，能非常有效地增加皮膚組織細(xì)胞的儲(chǔ)水能力，加強(qiáng)和維持肌膚良好的彈性、增加肌膚的韌性、延緩肌體的衰老。膠原蛋白具有良好的生物學(xué)特性，可用于組織修復(fù)、創(chuàng)傷、燒傷等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[14-15]，如Rafiuddin M等人[16]通過(guò)膠原蛋白研制成的交聯(lián)管狀神經(jīng)導(dǎo)管成功實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)再生。膠原蛋白同樣也具有生物相溶性、生物降解性、細(xì)胞適應(yīng)性、細(xì)胞增殖作用及促進(jìn)血小板凝聚等生物學(xué)性質(zhì)[17]。

2 膠原蛋白檢測(cè)方法的國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀

2.1 分光光度法

分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)某種光的波長(zhǎng)具有選擇性吸收的特性，來(lái)對(duì)物質(zhì)本身進(jìn)行定性以及定量分析的方法。此方法應(yīng)用范圍廣泛，對(duì)實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備要求較低，可以在普通實(shí)驗(yàn)室和企業(yè)應(yīng)用，但是特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性相對(duì)較差，測(cè)量結(jié)果也容易受多種因素的影響。Heng-bin G[18]用分光光度法檢測(cè)魚(yú)皮中膠原蛋白的含量，結(jié)果表明不同魚(yú)皮的膠原蛋白含量不同。此方法可以用來(lái)測(cè)定魚(yú)皮中膠原蛋白含量，以便于魚(yú)皮中膠原蛋白的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用。Lins[19]依據(jù)膠原蛋白水解的游離氨基酸中特有的HYP，測(cè)定其含量以計(jì)算膠原蛋白的含量，但其水解和衍生過(guò)程繁瑣且HYP含量隨生長(zhǎng)期不斷變化，所以不是所有來(lái)源的膠原蛋白都有確定的轉(zhuǎn)換系數(shù)。張笑通過(guò)分光光度儀對(duì)乳制品中的羥脯氨酸含量進(jìn)行測(cè)定，從而得知乳制品中是否添加了水解蛋白。

2.2 液相色譜法

高效液相色譜在實(shí)驗(yàn)室已越來(lái)越普及，具有靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用樣品范圍廣等特點(diǎn)，但是樣品需要衍生，步驟繁瑣易造成衍生不完全的情況發(fā)生。Nagai T[20]等人為提高水產(chǎn)品中膠原蛋白的利用率，采取柱前衍生-高效液相色譜法對(duì)鯽魚(yú)不同組織中的L-羥脯氨酸含量進(jìn)行檢測(cè)，此方法可應(yīng)用于不同水產(chǎn)品的組織中膠原蛋白的定量分析。Green GD[21]從膠原蛋白的組織提取物或溶液中測(cè)定羥脯氨酸的含量，最后得到膠原蛋白的濃度。Hu H等[22]為了區(qū)分醬油中是否添加酸水解蛋白液，通過(guò)液相色譜法檢測(cè)醬油樣品中HYP含量，在波長(zhǎng)360 nm下檢測(cè)，HYP的峰面積和質(zhì)量濃度在10～320 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.9992，回收率為97.2%～110.2%，LOD為2.5 mg/L。因此得出，如果在醬油中檢測(cè)有HYP的存在，說(shuō)明在醬油樣品中添加了水解植物蛋白或水解動(dòng)物蛋白。高效液相色譜法同樣也適用于乳及乳制品中羥脯氨酸的檢測(cè)，姜維等將乳制品中的膠原蛋白水解成HYP等氨基酸混合物，測(cè)定混合氨基酸中HYP的含量。

2.3 電泳法

該方法要求羥脯氨酸在柱前具有電活性，所以需將L-羥脯氨酸衍生，使其帶有一定的電荷，再進(jìn)行檢測(cè)。適用于膠原蛋白種類(lèi)的分析分離技術(shù)，具有進(jìn)樣量少、分辨率高、絕對(duì)靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，但是操作較為繁瑣。Mazorra-Manzano MA等[23]實(shí)驗(yàn)研究開(kāi)發(fā)一種通過(guò)毛細(xì)管電泳（CE）測(cè)定肉制品中羥脯氨酸含量的方法，從而得出膠原蛋白的量。Qiu H[24]等利用凝膠電泳法研究了C射線外照射對(duì)皮膚等組織中膠原代謝指標(biāo)的影響,利用該方法分離出分子量相近的膠原蛋白的含量。ONOUMA等[25]利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測(cè)定黃鰭金槍魚(yú)魚(yú)鰾膠原蛋白的分子量，進(jìn)而推測(cè)膠原蛋白的含量。Liang等[26]以磷酸鹽作為緩沖液，采用電泳法測(cè)定尿液中的HYP，濃度在1.3～262.0mg/L范圍內(nèi)線性良好，回收率為96.4%～101.2%，HYP的LOD為0.5mg/L。

2.4 氨基酸自動(dòng)分析儀法

該方法樣品處理操作簡(jiǎn)單，誤差小和自動(dòng)化程度高，能準(zhǔn)確、快速地檢測(cè)出膠原蛋白水解物中L-羥脯氨酸的含量，又可同時(shí)測(cè)定出其他16種水解氨基酸，但是此方法成本相對(duì)較高，分析耗時(shí)太長(zhǎng)，所以在基層實(shí)驗(yàn)室不好普及。PRABJEET等[27]用氨基酸自動(dòng)分析儀分析了巴丁魚(yú)皮中提取的酸溶性膠原蛋白和酶溶性膠原蛋白的氨基酸組成，從而得知L-羥脯氨酸的含量。Johnson RG[28]快速、準(zhǔn)確地測(cè)定糖胺聚糖(GAG)和膠原蛋白含量，分析了膠原蛋白結(jié)締組織類(lèi)型，從羥脯氨酸和羥賴氨酸值比計(jì)算膠原蛋白含量和測(cè)定膠原蛋白類(lèi)型。Cai M等[29]運(yùn)用氨基酸自動(dòng)分析儀快速測(cè)定牛乳中L-羥脯氨酸的方法，濃度0.05～1.0mmol/L范圍內(nèi)吸收度呈良好線性關(guān)系，平均回收率為91.5%，方法精密度為1.3%，最低檢出限0.66 mg/L。Messia等[30]報(bào)道了利用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定豬肉及豬肉制品中HYP的含量，方法回收率為97%～104%，RSD小于6.4%，此方法也可用于乳及乳制品中HYP的檢測(cè)，最后得出動(dòng)物水解蛋白含量。氨基酸自動(dòng)分析儀法同樣適用于乳與乳制品中是否添加動(dòng)物膠原水解蛋白的鑒定，如曾暖茜等利用氨基酸自動(dòng)分析儀準(zhǔn)確地測(cè)定乳制品中HYP含量，張秀堯?qū)⑷橹破匪崴夂笾苯佑冒被嶙詣?dòng)分析儀檢測(cè)。

2.5 質(zhì)譜檢測(cè)法

此方法流動(dòng)相簡(jiǎn)單，分析時(shí)間短且無(wú)需衍生處理，抗干擾能力強(qiáng)，能準(zhǔn)確快速地測(cè)定膠原蛋白的含量，但是儀器設(shè)備昂貴，檢測(cè)成本相對(duì)較高。Zheng YF等[31]通過(guò)高效液相色譜——質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定乳制品中是否摻加了膠原蛋白，可用于質(zhì)量監(jiān)督部門(mén)的乳制品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)。Nimptsch A等[32]基于質(zhì)譜法是利用酶法將膠原蛋白酶解成多肽片段，Gly-Pro-Hyp是膠原蛋白特異性肽段，對(duì)膠原蛋白進(jìn)行定量分析。Colgravea等[33]用質(zhì)譜檢測(cè)法測(cè)定綿羊半膜肌中的HYP含量，HYP的濃度在4.9～5000 nmol/L范圍內(nèi)線性良好，回收率在90%～108%之間，其LOD為640 mg/L，從而得出綿羊半膜肌中膠原蛋白的含量。質(zhì)譜檢測(cè)法被劉思潔等人制訂為吉林省地方標(biāo)準(zhǔn)（乳與乳制品中羥脯氨酸的測(cè)定DB S22/010-2012），對(duì)乳與乳制品中HYP進(jìn)行檢測(cè)。

2.6 離子色譜法

離子色譜法有分析速度快、樣品用量少、多組分同時(shí)分析等優(yōu)點(diǎn)，但是定性分析能力相對(duì)較差，不適合乳與乳制品中膠原蛋白的分析。Avery NC[34]實(shí)驗(yàn)研究利用離子色譜法測(cè)定膠原蛋白的含量，證明膠原蛋白具有一定的支撐作用。Yiping Z等[35]人利用離子色譜法測(cè)定魚(yú)鱗膠原蛋白中L-羥脯氨酸的含量，為工藝研究提供檢測(cè)理論依據(jù)，同時(shí)可作為判斷魚(yú)鱗膠原蛋白含量的一個(gè)定量指標(biāo)。

2.7 免疫學(xué)檢測(cè)法

免疫學(xué)檢測(cè)法的原理是通過(guò)抗原和抗體特異性結(jié)合后出現(xiàn)的各種現(xiàn)象，借助電子顯微鏡觀察其結(jié)果，來(lái)對(duì)樣品進(jìn)行定性及定量檢測(cè)。免疫學(xué)檢測(cè)法包括多種：如酶聯(lián)免疫檢測(cè)法、免疫電鏡法、放射免疫法、PV法[36]、免疫熒光法、免疫印跡法、ELISA間接法測(cè)定Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白、雙抗體夾心ELISA法測(cè)定血清Ⅳ型膠原蛋白。其中ELISA檢測(cè)法比較常用，是將膠原蛋白作為抗原與抗體結(jié)合再與辣根過(guò)氧化物酶（Horse radish peroxidase,HRP）或堿性磷酸酶（Al?kaline phosphatase，AKP）偶聯(lián)的抗體結(jié)合，經(jīng)化學(xué)顯色反應(yīng)，檢測(cè)顯色底物的吸光度值即可確定膠原蛋白的相對(duì)含量，但其每一步都需洗滌，過(guò)程較長(zhǎng)并不適于組織分析[37]。

2.8 天狼星紅法

天狼星紅法是通過(guò)天狼星紅可以與膠原蛋白發(fā)生特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)NaoH溶液對(duì)其進(jìn)行洗脫和離心，得到紅色復(fù)合物，通過(guò)分光光度儀測(cè)定吸光度從而確定膠原蛋白含量。Pilar等[38]通過(guò)天狼星紅法評(píng)估組織中膠原蛋白含量，該方法是基于Sirius紅與固定在PVDF膜上的樣品中存在的膠原蛋白的結(jié)合，并且通過(guò)掃描儀和圖像分析軟件確定膠原蛋白含量。此方法需要無(wú)氧介質(zhì)或昂貴的設(shè)備和大樣本的要求，不適合乳與乳制品中水解膠原蛋白和組織分析。

2.9 傳統(tǒng)的干重法

傳統(tǒng)的干重法是將原料進(jìn)行一系列加工處理，從中提取出雜膠原蛋白，經(jīng)凍干得到膠原蛋白，最后測(cè)干重分?jǐn)?shù)，過(guò)程非常繁瑣且靈敏度相對(duì)較低[39-40]，不適合乳與乳制品中膠原蛋白的檢測(cè)分析。

3 結(jié)束語(yǔ)

近年來(lái)，許多研究人員對(duì)膠原蛋白的檢測(cè)做了深入細(xì)致的研究，總結(jié)出許多不同的方法，每種方法都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，現(xiàn)有檢測(cè)乳與乳制品中膠原蛋白的方法都需要一定的儀器設(shè)備，難以滿足現(xiàn)場(chǎng)進(jìn)行快速檢測(cè)，因此將來(lái)需要研制出更加快捷、準(zhǔn)確，經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)手段（如測(cè)試片、試紙條等）。目前所采用的主要方法為高效液相色譜法，該方法國(guó)內(nèi)外應(yīng)用最為廣泛，適用于乳制品及膠原蛋白等產(chǎn)品。檢測(cè)膠原蛋白的所有方法都是測(cè)定其中L-羥脯氨酸的含量，再乘以相對(duì)應(yīng)膠原蛋白換算系數(shù)，最后得出膠原蛋白的總量。對(duì)于膠原蛋白中含L-羥脯氨酸的比例系數(shù)，不同物種互不相同，即使同種生物不同部位也存在差異，導(dǎo)致沒(méi)有一個(gè)規(guī)范的數(shù)值，因此對(duì)膠原蛋白換算系數(shù)引用混亂。根據(jù)相關(guān)資料報(bào)道：豬骨6.12～6.17、豬皮10左右、雞骨6.27～6.30、羊骨6.34～6.35、牛骨6.77左右、牛皮7.94～8.85、深海魚(yú)皮16.67左右、淡水魚(yú)皮10.41～11.36、淡水魚(yú)鱗12.5左右、鱘魚(yú)鰭9.01左右、林蛙皮6.49左右等。所以，尋找更加簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地膠原蛋白檢測(cè)方法應(yīng)為國(guó)內(nèi)外學(xué)者的研究方向。

[1]BAMA P,VIJAYALAKSHIMI M,JAYASIMMAN R,et al.Extrac?tion of collagen from cat fish(Tachysurus maculatus)by pepsin diges?tion and preparation and characterization of collagen chitosan sheet[J].J Pharm Pharm Sci,2010,2(4):133-137.

[2]QUERESHI S,MHASKE A,RAUT D,et al.Extraction and partial characterization of collagen from different animal skins[J].Res Sci Technol,2010,2(9):28-31.

[3]LIN Y K,LIN D C.Comparison of physical-chemical properties of type I collagen from different species[J].Food Chem,2006,99(2):244-251.

[4]BING Q,FENGXIANG W,XIUZHI S,et al.Measurement of hy?droxyproline in collagen with three different methods[J].Molecular Medicine Reports,2014,10(2):1157-1163.

[5]FARVIN K H S,ANDERSEN L L,NIELSENH H,et al.Antioxi?dant activity of Cod（Gadus morhua）protein hy-drolysates:In vitro as?says and evaluation in 5%fish oil-in-water emulsion[J].Food Chemis?try,2014,149(15):326-334.

[6]GóMEZ-GUILLéN M C,GIMéNEZ B,LóPEZ-CABALLERO M E,et al.Functional and bioactive properties of collagen and gelatin from alternative sources:A review[J].Food Hydrocoll,2011,25(8):1813-1827.

[7]JOHN A M RAMSHAW.Biomedical applications of collagens[J].Journal of Biomedical Materials Research Part B:AppliedBiomaterials,2016,104(4):665-675.

[8]LIU D,LIANG L,REGENSTEIN J M,ZHOU P.Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins,scales,skins,bones and swim bladders of bighead carp(Hypophthalmichthys nobilis)[J].Food Chem,2012,133(4):1441-1448.

[9]JIA YUANJUN,WANG HAIBO,WANG HAIYIN,et al.Biochemi?calproperties of skin collagens isolated from black carp(Mylopharyngo?don piceus)[J].Food Science and Biotechnology,2012,21(6):1585-1592.

[10]FARVIN K H S,ANDERSEN L L,NIELSENH H,et al.Antioxi?dant activity of Cod(Gadus morhua)protein hy-drolysates:In vitro assays and evaluation in 5%fish oil-in-water emulsion[J].Food Chemistry,2014,149(15):326-334.

[11]CLICHE J,AMIOT A.Extraction and Characterization of Collagen with or without Telopeptides from Chicken Skin[J].Poultry Sci?ence,2003,82(3):503-509.

[12]FERREIR AM,GENTILE P,CHIONO V,et al.Collagen for bone tissue regeneration[J].Acta Biomaterialia,2012,8(9):3191-3200.

[13]RIICHIRO O,TOMOAKI D.Physiological Functions of Enzymat?ic Hydrolysates of Collagen or Keratin Contained in Livestock and Fish Waste[J].Food Science and Technology Research,2003,9(1):91-93.

[14]PARENTEAU-BAREIL R,GAUVIN R,BERTHOD F.Colla?gen-based biomaterials for tissue engineering applications[J].Materi?als,2010,3(3):1863-1887.

[15]SCHWEIZER S,BICK A,SUBRAMANIAN L,et al.Influences on the stability of collagen triple-helix[J].Fluid Phase Equilibria,2014,362(1):113-117.

[16]RAFIUUDDIN M,VENKATESHWARLU U,JAYAKUMAR R.Multilayered peptide incorporated collagen tubules for peripheral nerve repair[J].Biomaterials,2004,25(13):2585-2594.

[17]SHOULDERS M D,RAINES R T.Collagen structure and stability[J].Annu Rev Biochem,2009,78:929-958.

[18]HENG-BIN G,QING-ZHU Z,LEI Y,CUI W.Spectrophotomet?ric determination of hydroxyproline content in fish skins[J].Modern Food Science and Technology,2007,23(7):81-83.

[19]LINS DA SILVA CM,SPINELLI E,RODRIGUES SV.Fast and sensitive collagen quantification by alkaline hydrolysis/hydroxypro?line assay[J].Food Chem,2015,173:619-623.

[20]NAGAI T,SUZUKI N,NAGASHIMA T.Collagen from common minke whale unesu[J].Food Chemistry,2008,111(2):296-301.

[21]GREEN GD,REAGAN K.Determination of hydroxyproline by high pressure liquid chromatography[J].Anla.Bioche,1992,201:265-269.

[22]HU H,LV D,DU Q,et al.Detection of hydroxyproline in soy sauc?es by high performance liquid chromatography[J].China Condiment,?2010,4(35):106-109.

[23]MAZORRA-MANZANOMA,TORRES-LLANEZMJ,GONZáLEZ-CóRDOVA A F,et al.A Capillary Electrophoresis Method for the Determination of Hydroxyproline as a Collagen Content Index in Meat Products[J].Food Analytical Methods,2012,5(3):464-470.

[24]QIU H,WU S,XU L,et al.Effects of external gamma radiation on collagen metabolism and other indexes[J].Chinese Journal of Radio?logical Medicine and Protection,2004,24:102-104.

[25]ONOUMA K,SOOTTAWAT B,THAMMARAT K,et al．Char?acteristics of collagen from the swim bladders of yellowfin tuna(Thunnus albacares)[J].Food Chemistry,2014,155(1):264-270.

[26]LIANG H,XUE J,LI T,et al.A rapid capillary electrophoresis with electroche milum in escence method for the assay of human urinary proline and hydroxyprol[J].Luminescence,2005,20:287-291.

[27]PRABJEET S,SOOTTAWAT B,SAJID M,et al.Isolation and char?acterisation of collagen extracted from the skin of striped cat?sh(Pan?gasianodonhypophthalmus)[J].FoodChemistry,2011,124(5):97-105.

[28]JOHNSON RG,STOLLERY J,KEELEY FW,HERBERT MA.Biochemical analysis of rabbit articular cartilage using an amino acid analyzer[J].Clinical Orthopaedics&Related Research,1979,?&NA;?(146)?:282-288.

[29]CAI M,JI W L,LUI H L,et al.Rapid determination of hydroxypro?line in milk by amino acid automatic analyzer[J].China J Food Hyg,2014,24(6):542-545.

[30]MESSIA M C,DIFALCO T,PANFILI G,et al.Rapid determina?tion of collagen in meat-based foods by microwave hydrolysis of pro?teins and HPAEC-PAD analysis of 4-hydroxyproline[J].Meat Sci,2008(80):401-409．

[31]ZHENG Y F,ZHU G Q,ZENG J H,et al.Identification of collage?nous protein in dairy products by high performance liquid chroma?tography-mass spectrometry[J].China Diary Ind,2013,41(9):56-58.

[32]NIMPTSCH A,SCHIBUR S,IHLING C,et al.Quantitative analy?sis of denatured collagen by collagenase digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry[J].Cell Tissue Res,2011,343(3):605-617.

[33]COLGRAVE ML,ALLINGHAM PG,JONES A.Hydroxyproline quantification for the estimation of collagen intissue using multiple re?action monitoring mass spectrometry[J].Journal of Chromatography A,2008,1212(1-2):150-153.

[34]SIMS T J,AVERY N C,BAILEY A J.Quantitative determination of collagen cross-links[J].Methods in Molecular Biology,2009:139(522):11-26.

[35]YIPING Z,RUIZAO Y,et al.Study on the determination of hy?droxyproline in fish scale collagen by Ion Chromatography[J].Chi?nese Journal of marine medicine,2011,30(4):45-48.

[36]HAN T L,WANG M,YAN X Y,et al.Decreased expression of type I collagen and dentin phosphoprotein in teeth of fluorosed sheep[J].Fluorid,2010,43(1):19-24.

[37]NAYAN J S,VENKATASWARUP T,MOHANAKUMAR T.De?tection of antibodies to self-antigens(k-alpha 1 tubulin,collagen I,II,IV,and V,myosin,and vimentin)by enzyme-linked immunosor?bent assay(ELISA)[J].Humana Press,2013,1034:335-341.

[38]PILAR R,SILVIA M A,PABLO A L,et al.A simple dot-blot-Siri?us red-based assay for collagen quantification[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(21):6863-6871.

[39]NUNTAPORN A,WUNWIBOON G.Temperature effects on type I pepsin-solubilised collagen extraction from silver-line grunt skin and its in vitro fibril self-assembly[J].Journal of the Science of Food&Agriculture,2010,90(15):2627-2632.

[40]WANG L,YANG B,DU X.Extraction of acid-soluble collagen from grass carp(Ctenopharyngodon idella)skin[J].Journal of Food Process Engineering,2009,32(5):743-751.