劉舜莉 梁澤鑫 祁瑞娟 廣東省醫(yī)療器械質(zhì)量監(jiān)督檢驗所 （廣東 廣州 510663）

GB/T 19973-2015《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法》分為兩個部分，第一部分為產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測定，第二部分為用于滅菌過程的定義、確認(rèn)和維護(hù)的無菌試驗。本文主要對GB/T 19973-2015的第一部分進(jìn)行解讀，該部分等同采用ISO11737-1:2006《醫(yī)療器械的滅菌 微生物學(xué)方法 第1部分：產(chǎn)品上微生物總數(shù)的測定》，該部分主要對生物負(fù)載測定的質(zhì)量管理體系要素、產(chǎn)品選擇、測定方法和微生物鑒定方法以及測定方法的確認(rèn)等方面進(jìn)行了規(guī)范。本標(biāo)準(zhǔn)作為推薦性標(biāo)準(zhǔn)，對于指導(dǎo)醫(yī)療器械制造商進(jìn)行生產(chǎn)環(huán)境、物料、初加工產(chǎn)品及終產(chǎn)品等的生物負(fù)載水平測定和監(jiān)控具有極大的指導(dǎo)意義。為了對滅菌過程和/或產(chǎn)品生產(chǎn)過程進(jìn)行持續(xù)監(jiān)控，大多數(shù)國家和國際標(biāo)準(zhǔn)在生物負(fù)載、滅菌和環(huán)境監(jiān)控等方面均要求建立相應(yīng)的警戒限和糾偏限，GB/T 19973.1-2015中條款A(yù).8.5至A.8.7給出了環(huán)境和產(chǎn)品生物負(fù)載水平監(jiān)控的一般指導(dǎo)原則，但并未給出詳細(xì)的指導(dǎo)方法。為了更好的理解和實施該標(biāo)準(zhǔn)，本文從警戒限和糾偏限的定義、生物負(fù)載測定實施要點、超出警戒限和糾偏限的相關(guān)調(diào)查以及生物負(fù)載測定與醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系等方面進(jìn)行介紹。

1.警戒限和糾偏限定義

ISO 11737-1:2006[1]沒有給出警戒限和糾偏限的定義，標(biāo)準(zhǔn)中有對建立生物負(fù)載水平線的討論，但是沒有涉及建立水平線的具體方法。PDA Technical Report No.13一文中對警戒限和糾偏限給出了如下定義：“警戒限：一旦超過該水平即預(yù)示著運(yùn)行程序已偏離正常運(yùn)行條件，構(gòu)成警告但不必啟動糾正措施。糾偏限：一旦超過該水平即預(yù)示著運(yùn)行程序已超出正常運(yùn)行區(qū)間，作為回應(yīng)，應(yīng)啟動文件調(diào)查和糾正措施[2]”。美國藥典（1116）中關(guān)于警戒限和糾偏限的定義如下所述，“警戒限：按照標(biāo)準(zhǔn)測試方法統(tǒng)計得到的生物負(fù)載水平，一旦超過該水平，即須啟動調(diào)查以確保工藝過程依然受控。對于某一設(shè)施的警戒限是特定的，并且是在環(huán)境監(jiān)測基線的基礎(chǔ)上建立的?？梢愿鶕?jù)環(huán)境監(jiān)測數(shù)據(jù)的分析來對警戒限進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，警戒限始終低于糾偏限。糾偏限：在受控環(huán)境中依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)測試方法統(tǒng)計得到的生物負(fù)載水平，一旦超過該水平，應(yīng)立即啟動文件調(diào)查和相應(yīng)的糾正措施”[3]。美國食品藥品監(jiān)督管理局給出的定義如下：“警戒限：建立的微生物或空氣中顆粒物水平，一旦超過該水平，則預(yù)示運(yùn)行程序偏離正常運(yùn)行條件，構(gòu)成警告，宜采取適當(dāng)?shù)膶彶楹透櫼越鉀Q潛在的問題，警戒限始終低于糾偏限。糾偏限：建立的微生物或空氣中顆粒物水平，一旦超出該水平，應(yīng)啟動調(diào)查并采取相應(yīng)的糾正措施”[4]?？梢姡煌慕M織機(jī)構(gòu)對于警戒限和糾偏限的理解有所差異，通過對以上定義的分析比較，總結(jié)如下，警戒限：超出該水平，預(yù)示著生產(chǎn)過程偏離正常運(yùn)行程序，構(gòu)成警告，不需要采取行動，但是對于經(jīng)常超出警戒限的重復(fù)性偏差，則視同超出糾偏限，應(yīng)當(dāng)按照超出糾偏限情形對待，執(zhí)行相應(yīng)的糾正措施。糾偏限：超出該水平，預(yù)示生產(chǎn)過程已偏離正常運(yùn)行條件，必須對此進(jìn)行調(diào)查，并采取糾正措施。

2.建立警戒限和糾偏限實施要點

醫(yī)療器械制造商應(yīng)認(rèn)識到生物負(fù)載測試的重要性，這關(guān)系到醫(yī)療器械最終的整體安全性和產(chǎn)品性能，制造商通過對材料、生產(chǎn)、人員和環(huán)境的監(jiān)控，對微生物污染水平進(jìn)行控制，生物負(fù)載的測試結(jié)果代表著產(chǎn)品的控制水平。醫(yī)療器械制造商在建立環(huán)境和產(chǎn)品的警戒限和糾偏限過程中，應(yīng)當(dāng)考慮以下要點，以確保收集到的生物負(fù)載測試數(shù)據(jù)具有代表性。

首先，抽樣計劃對于整個生產(chǎn)批次應(yīng)能有代表性。PDA Technical Report No.21規(guī)定：“應(yīng)從批次內(nèi)的不同位點抽取樣品，以便代表整個批次。隨機(jī)選擇樣本，通常包含批次位置的開始，中間和結(jié)束階段。如果某一生產(chǎn)批次專門用于測試，則必須特別小心，確保該批次樣品能夠代表常規(guī)生產(chǎn)情況”[5]。

其次，生物負(fù)載數(shù)據(jù)應(yīng)該在較長時間內(nèi)收集。PDA Technical Report No.21指出：“應(yīng)分析原材料和/或生產(chǎn)過程生物負(fù)載水平是否因季節(jié)性差異對系統(tǒng)生物負(fù)載水平產(chǎn)生較大影響”[5]。這點在GB/T 19973.1-2015附錄A.8.1中也有所體現(xiàn)，即“生物負(fù)載測定頻率宜能對例如因季節(jié)變更、生產(chǎn)變化或材料改變引起的生物負(fù)載中的變化進(jìn)行檢測”。為了數(shù)據(jù)的真實可靠，建議收集一年以上的生物負(fù)載數(shù)據(jù)。

再次，至少使用4組數(shù)據(jù)。理論上，建立警戒和糾偏限的收集數(shù)據(jù)越多，就越具有代表性，而對于小數(shù)據(jù)集，誤差可能相當(dāng)大。隨著收集數(shù)據(jù)的增多，誤差將減小。實際情形中，為了顧及成本及工作效率，制造商并不會無限制的收集生物負(fù)載數(shù)據(jù)，而僅對部分測試數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。這里給出一個參考數(shù)據(jù)，每年每季度測試10個樣本（即全年40個數(shù)據(jù)），通常可以提供足夠的數(shù)據(jù)以建立警戒限和糾偏限。

最后，應(yīng)采用經(jīng)驗證的回收率來評估產(chǎn)品和/或環(huán)境生物負(fù)載水平。應(yīng)對每個樣本類型（例如最少3個樣本）進(jìn)行回收率驗證，并在評估前應(yīng)用于所有數(shù)據(jù)。如果隨時間推移，計算得到多個不同回收率，則取所有回收率的平均值，并將該平均回收率應(yīng)用于所有數(shù)據(jù)。當(dāng)進(jìn)行生物負(fù)載評估時，采用相同的回收率得到的數(shù)據(jù)偏差較小。需要注意，只要每組數(shù)據(jù)對應(yīng)的回收方法一致，上述做法則適用，如回收方法不一致，則不宜按上述方法進(jìn)行統(tǒng)計分析。在生物負(fù)載標(biāo)準(zhǔn)中，校正因子可采用回收率數(shù)據(jù)[1]。

3.超出警戒限和糾偏限的調(diào)查

對于超出警戒限和糾偏限情形的調(diào)查，重要的是要了解具體的調(diào)查內(nèi)容，以期建立合適的監(jiān)控水平。在此建議，建立的監(jiān)控水平不宜過于嚴(yán)格，以防止超水平后高頻率的調(diào)查造成的高工作量。PDA Technical Report No.13指出，“通過偏差建立的數(shù)學(xué)模型能夠?qū)Πl(fā)生水平偏移的情況進(jìn)行合理的概率分析”，例如，在高于歷史生物負(fù)載估值2倍標(biāo)準(zhǔn)偏差水平建立的警戒限，預(yù)計超過該水平的可能性為0.02275[2]。應(yīng)注意，即便過程受控，偶爾也會有個別離群值超出警戒限或糾偏限。這在GB/T19973.1-2015條款A(yù).8.5中有所體現(xiàn)，即“對一給定產(chǎn)品，由生物負(fù)載測定得到的數(shù)據(jù)可能不會嚴(yán)格服從一個公認(rèn)的數(shù)學(xué)分布。尤其是某些數(shù)據(jù)出現(xiàn)許多零計數(shù)（有少許高計數(shù)）”。當(dāng)單個值超出糾偏限時，建議不啟動文件調(diào)查，但可對此進(jìn)行原因分析。一般來說，建立警戒限和糾偏限的初衷，主要關(guān)注的應(yīng)該是生物負(fù)載趨勢，而不是個別離群值。產(chǎn)品生物負(fù)載可能來自環(huán)境、人員、原材料、設(shè)備、制造過程等環(huán)節(jié)，這些環(huán)節(jié)中的每一個因素都可以用于調(diào)查生物負(fù)載偏移以確定根本原因以及應(yīng)當(dāng)如何防止再次發(fā)生。

對于警戒限，主要考慮以下因素：①常規(guī)生物負(fù)載趨勢（產(chǎn)品和環(huán)境）的數(shù)量和類型；②回收微生物的鑒定；③評估微生物對滅菌過程的抵抗力；④生產(chǎn)人員影響（例如適當(dāng)?shù)呐嘤?xùn)或新人員）；⑤生產(chǎn)過程的變化；⑥取樣和測試步驟的變化；⑦實驗室控制和監(jiān)視器的評估；⑧附加測試；⑨生產(chǎn)區(qū)域的清潔、消毒；⑩采樣計劃的修改；?原材料和供應(yīng)商的變更；?水源污染。

對于糾偏限，除了上述考慮因素，還應(yīng)包括：①根本原因分析/調(diào)查；②確定對滅菌規(guī)范的潛在影響。

當(dāng)建立警戒和糾偏限時，應(yīng)有相應(yīng)的調(diào)查計劃。為了針對具體的情形做出靈活性的應(yīng)對，該調(diào)查計劃不宜太具體[2]。

警戒限和糾偏限不應(yīng)作為釋放產(chǎn)品的唯一標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)生物負(fù)載水平高于警戒限時，不意味著產(chǎn)品應(yīng)當(dāng)丟棄或不合格；當(dāng)生物負(fù)載水平高于糾偏限時，也并不表示產(chǎn)品不合格。只有當(dāng)生物負(fù)載水平可能引起滅菌周期適當(dāng)性的質(zhì)疑時，則預(yù)示著產(chǎn)品生產(chǎn)過程存在著高風(fēng)險因素。

4.生物負(fù)載測定與醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系

生物負(fù)載測定與環(huán)氧乙烷、輻照滅菌滅菌過程的開發(fā)具有非常密切的關(guān)系。環(huán)氧乙烷滅菌主要有過度殺滅法、生物指示物/生物負(fù)載結(jié)合法和基于周期的完全生物負(fù)載法3大方法，其中涉及生物負(fù)載的就有2大方法。GB 18279.1-2015《醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌 環(huán)氧乙烷 第1部分：醫(yī)療器械滅菌過程的開發(fā)、確認(rèn)和常規(guī)控制的要求》附錄A收錄了生物指示劑和生物負(fù)載結(jié)合法進(jìn)行滅菌過程殺滅率的確定方法，該方法是利用BI菌量反映產(chǎn)品生物負(fù)載總數(shù)。BI所含有的菌量等于生物負(fù)載平均值加上3個標(biāo)準(zhǔn)偏差，以用于建立達(dá)到期望的SAL所需的參數(shù)。實施生物指示物/生物負(fù)載法需考慮將生物指示物置于產(chǎn)品和裝載中對滅菌過程最具有挑戰(zhàn)性的位置。只有在數(shù)據(jù)充分能進(jìn)行有效的統(tǒng)計分析，且生物負(fù)載數(shù)據(jù)代表了“最惡劣”的條件，具有高置信度水平時，該方法才適用。生物負(fù)載的類型和數(shù)量應(yīng)始終保持一致，且有數(shù)據(jù)證實用于設(shè)定滅菌周期的信息反映最惡劣的滅菌挑戰(zhàn)。產(chǎn)品上生物負(fù)載的測定方法應(yīng)經(jīng)過確認(rèn)，且應(yīng)在該方法確認(rèn)過程中規(guī)定選擇生物負(fù)載樣品的方法。YY/T 1302.2-2015《環(huán)氧乙烷滅菌的物理和微生物性能要求 第2部分：微生物要求》中除收錄生物指示物/生物負(fù)載結(jié)合法外，還介紹了周期開發(fā)的完全生物負(fù)載法，不過該方法的開發(fā)過程要求極其嚴(yán)格，需要在開發(fā)階段及日常生產(chǎn)控制中進(jìn)行大量的生物負(fù)載評估工作，需要對所應(yīng)用的生物負(fù)載測定方法進(jìn)行回收率的驗證開發(fā)以及對篩選得到的微生物進(jìn)行微生物鑒定，同時需要較高生產(chǎn)環(huán)境和生產(chǎn)控制水平[8]。對于輻照滅菌，由于其滅菌機(jī)制是用γ射線或電子束對微生物進(jìn)行隨機(jī)“射擊”，對微生物的殺滅率取決于擊中率，產(chǎn)品上微生物的數(shù)量越多，保證達(dá)到10-6的無菌保證水平所需的“射擊”的密度或時間（即輻照劑量）就要相應(yīng)增加。但隨輻照劑量的增大，滅菌過程對材料的破壞也隨之增大。因此，對于采用輻照滅菌的器械產(chǎn)品，控制醫(yī)療器械產(chǎn)品的生物負(fù)載的水平就顯得格外重要，另外，由于找不到一種更耐輻照的生物指示物，輻照滅菌不能像濕熱滅菌和環(huán)氧乙烷滅菌那樣用生物指示物來控制產(chǎn)品放行。輻照滅菌只能按照GB18280和GB/T19973對滅菌過程進(jìn)行確認(rèn)，且需按照GB/T19973.1-2015對生產(chǎn)過程引入的微生物污染因素進(jìn)行監(jiān)控。

5.結(jié)語

綜上所述，本文從警戒限和糾偏限的定義、基于生物負(fù)載測定數(shù)據(jù)建立警戒限和糾偏限實施要點、超出警戒限和糾偏限的相關(guān)調(diào)查及生物負(fù)載測定與醫(yī)療保健產(chǎn)品滅菌標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系等方面對GB/T19973.1-2015進(jìn)行解讀，ISO11737（GB/T19973系列標(biāo)準(zhǔn)）與ISO11137（GB18280系列標(biāo)準(zhǔn)）系列標(biāo)準(zhǔn)作為同一ISO項目組的起草標(biāo)準(zhǔn)，兩大系列標(biāo)準(zhǔn)間存在著莫大的關(guān)聯(lián)，對GB/T19973.1的標(biāo)準(zhǔn)解讀也應(yīng)當(dāng)與GB18280.1-2015、GB18280.2-2015、GB18279.1-2015、GB/T 18279.2-2015及GB/T 19973.2-2005等標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來，作為一個整體共同解讀。2017年3月23日，由國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局、國家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會發(fā)布公告（國家標(biāo)準(zhǔn)委2017年第6號公告）稱，GB 15980-1995《一次性使用醫(yī)療用品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》等396項強(qiáng)制性標(biāo)準(zhǔn)廢止。作為ISO 11737.1:2006的等同轉(zhuǎn)化標(biāo)準(zhǔn)的GB/T 19973.1-2015，提供了生物負(fù)載測定方法，能夠有效填補(bǔ)GB15979-1995標(biāo)準(zhǔn)廢止帶來的監(jiān)管空白，同時為了更好的與國外接軌和為了我國生產(chǎn)的醫(yī)療器械產(chǎn)品獲得更高的認(rèn)可度，GB/T 19973.1-2015這個標(biāo)準(zhǔn)對于指導(dǎo)國內(nèi)醫(yī)療器械的微生物檢驗控制具有重大意義。

[1] ISO. Sterilization of medical devices-Microbiological methods-Part 1:Determination of a population of microorganisms on products[S].ISO 11737-1:2006[S].2006.

[2] Listed N. Fundamentals of an environmental monitoring program. Technical Report No.13.Revised. Parenteral Drug Association[J]. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology,2001,55(5):267-272.

[3] The United States Pharmacopeia-National Formulary.＜1116＞ Microbiological Evaluation of Clean Rooms and Other controlled Environments, USP 34-NF 29[C]. Pharmacopeial Formu,2012,36(6):633.

[4] U.S. Department of Health and Human Sercives Food and Drug Administration, CEDR, CBER, et al. Guidance for industry, Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing-Current Good Manufacturing Practice[S]. Pharmaceutical CGMPs,2004.

[5] PDA Bioburden Recovery Validation Task Force, Technical Report No.21:Bioburden Recovery Validation[J]. Journal of Parenteral Science & Technology,1990,44(6):S1-S8.

[6] ISO 11137-1:2006-Sterilization of health care products-Radiation-Part 1:Requirements for development, validation and routine control of a sterilization process for medical devices[S].2006.

[7] ISO11137-2:2006-Sterilization of health care products-Radiation-Part 2:Establishing the sterilization dose[S].2006.