高松 蔣刈 戴樸

產(chǎn)前診斷是遺傳性疾病早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早治療的重要手段，可以有效減少出生缺陷的發(fā)生風(fēng)險。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷是通過有創(chuàng)的方式，包括羊膜穿刺術(shù)、絨毛膜絨毛吸取術(shù)、胎兒臍靜脈穿刺術(shù)，獲取胎兒遺傳物質(zhì)用于遺傳分析，對胎兒和孕婦有一定的風(fēng)險[1]。因此，無創(chuàng)產(chǎn)前診斷逐漸成為研究的熱點。無創(chuàng)產(chǎn)前診斷中胎兒遺傳物質(zhì)的來源包括孕婦外周血中游離胎兒DNA和完整的胎兒細(xì)胞。相對于胎兒游離DNA，胎兒細(xì)胞包含胎兒完整的遺傳信息，能提供更準(zhǔn)確可靠的基因診斷。研究證實，孕婦外周血中主要存在4種胎兒來源的細(xì)胞，即滋養(yǎng)層細(xì)胞、白細(xì)胞、造血干細(xì)胞和有核紅細(xì)胞[2]。4種細(xì)胞中胎兒有核紅細(xì)胞(fetal nucleated red blood cells，F(xiàn)NRBC)是最理想的產(chǎn)前檢測的來源細(xì)胞，其優(yōu)勢包括：(1)胎兒有核紅細(xì)胞是單核細(xì)胞，分化好，形態(tài)上易辨別，含有胎兒完整的遺傳信息；(2)存活周期約90 d，在母體血循環(huán)中不會持續(xù)至下次妊娠，因此，作為產(chǎn)前檢測細(xì)胞來源不受上次妊娠的影響[3]；(3)細(xì)胞表面具有特異性的標(biāo)志物，可作為細(xì)胞分選的依據(jù)。

胎兒有核紅細(xì)胞直徑約9～13 μm，略大于成熟紅細(xì)胞的直徑(6～8 μm)，與白細(xì)胞直徑(8～15 μm)相當(dāng)；密度在1.077 g/ml至1.130 g/ml之間，與成熟紅細(xì)胞(1.090～1.110 g/ml)相似[4-5]。孕婦外周循環(huán)中胎兒細(xì)胞數(shù)量很少，據(jù)估計每1 ml孕婦外周血中約有1～3個胎兒細(xì)胞[6]。妊娠的不同階段，胎兒細(xì)胞數(shù)量也會有所不同。胎兒有核紅細(xì)胞自孕6周即可在孕婦外周血中檢出，隨著妊娠期延長，胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)量逐漸增加，每40 ml孕婦外周血中由孕6周時的100個增加到孕末期的1 000個[7-8]。有研究認(rèn)為，孕婦外周血中胎兒細(xì)胞數(shù)量與胎兒性別有關(guān)，胎兒為男性的孕婦外周血中胎兒細(xì)胞數(shù)量較多[9]。由于胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)量稀少，必須對其進行分離富集，才能用于無創(chuàng)產(chǎn)前檢測。

一、孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞分離和富集主要方法

1. 密度梯度離心法(density gradient centrifugation, DGC)：該技術(shù)主要原理是根據(jù)外周血中各種細(xì)胞成份在密度、體積和沉降系數(shù)等方面的差異，利用細(xì)胞分離液通過離心的方法將目標(biāo)細(xì)胞分離出來。根據(jù)所采用的介質(zhì)密度的不同，可以分為單密度梯度離心、雙密度梯度離心和不連續(xù)密度梯度離心。二十世紀(jì)九十年代，有研究證明該方法在富集有核細(xì)胞、去除母源性紅細(xì)胞過程中的作用。Ganshirt-Ahlert等[10]采用不連續(xù)三重密度梯度在非整倍體妊娠的中晚期成功富集了胎兒有核紅細(xì)胞。Bhat等[11]采用Histopaque 1077、1107和1119三重密度離心的方法，與采用Histopaque 1077單密度離心方法相比，前者對血液模擬樣本中有核紅細(xì)胞的富集效率是后者的25倍。之后，密度梯度離心法成為大部分富集策略的第一步。Sekizawa等[12]評估了不同密度梯度離心法分離胎兒有核紅細(xì)胞的效率，采用熒光標(biāo)記的抗γ-血紅蛋白抗體分選胎兒有核紅細(xì)胞，并進一步行FISH分析，結(jié)果顯示采用1.090 g/ml密度梯度富集的胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)量是1.083 g/ml的3倍多。有學(xué)者采用Percoll分離液研究胎兒有核紅細(xì)胞的密度，顯示大多數(shù)胎兒有核紅細(xì)胞的密度比白細(xì)胞密度大[13]。因此，多數(shù)學(xué)者傾向采用密度更大的Ficoll 1119做為密度梯度離心法的介質(zhì)[14-15]。同時有研究[12]比較了Percoll和Ficoll兩種分離液的富集效率，針對孕早期模擬樣本中回收胎兒原始紅細(xì)胞，Percoll 1118明顯優(yōu)于Percoll 1117、1119和Ficoll 1119，其平均回收率分別為64.1%、10.1%、5.5%和35.3%。密度梯度離心法操作相對簡便，耗時短，費用低，但該技術(shù)富集所得胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)量少，純度較低，通常作為富集有核紅細(xì)胞策略的第一步，后續(xù)進一步純化目標(biāo)細(xì)胞。

2. 熒光激活細(xì)胞分選法(fluorescence-activated cell sorting, FACS)：FACS是用結(jié)合有熒光染料的探針(如抗體)對細(xì)胞進行標(biāo)記，再進行流式細(xì)胞分選術(shù)。1979年首次報道了采用FACS方法從孕婦外周血中成功分離出胎兒細(xì)胞[16]，之后有學(xué)者以胎兒有核紅細(xì)胞上CD71為靶點，應(yīng)用FACS策略從孕婦外周血中成功獲取胎兒有核紅細(xì)胞，并在懷男胎孕婦外周血細(xì)胞中檢測到Y(jié)染色體序列[17]。 Price等[18]采用密度梯度離心和FACS(細(xì)胞大小、粒度、CD71和GPA)相結(jié)合的方法從富集的胎兒細(xì)胞中分離有核紅細(xì)胞，進一步用PCR的方法成功鑒定出全部12例男胎以及6例女胎中的5例，染色體特異的核酸探針熒光原位雜交技術(shù)(FISH)診斷出1例21-三體和1例18-三體。Bianchi等[19]采用不同的三種抗體(CD71單抗、CD36單抗、GPA單抗)FACS與密度梯度離心相結(jié)合的方法分離胎兒有核紅細(xì)胞后，再行性別鑒定；其中用CD71單抗和CD36單抗的準(zhǔn)確率分別為57%、88%；無論單獨應(yīng)用GPA單抗或與CD71單抗、CD36單抗聯(lián)合應(yīng)用，結(jié)果準(zhǔn)確率均為100%。但由于FACS設(shè)備昂貴，操作復(fù)雜，并且檢測通量低，目前并不適用于臨床。

3. 磁激活細(xì)胞分選法(magnetic-activated cell sorting, MACS)：MACS是一種免疫磁性細(xì)胞分離技術(shù)，采用結(jié)合磁性微粒的單抗與細(xì)胞表面的特異抗原結(jié)合，然后通過外加磁場，將互相結(jié)合的磁性微粒和目標(biāo)細(xì)胞與其它細(xì)胞分開。G?nshirt-Ahlert等[10, 20]首次采用Histopaque-1077密度梯度離心結(jié)合CD71單抗包被的磁珠成功富集了胎兒有核紅細(xì)胞；隨后，該學(xué)者用三重密度梯度離心結(jié)合MACS(抗CD71)的方法富集胎兒有核紅細(xì)胞后，進一步用FISH的方法檢測出15例染色體異常的胎兒，其中5例18-三體，10例21-三體。Mavrou[21]等對孕中期母親外周血中胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)量進行了研究，采集受檢者20 ml外周血，Histopaque 1 083密度梯度離心，采用MACS(抗CD71)富集，經(jīng)麥格-姬姆薩(May-Griunwald-Giemsa, MGG)法染色后，顯微鏡下確認(rèn)有核紅細(xì)胞并計數(shù)，發(fā)現(xiàn)351例樣本中306例富集到胎兒有核紅細(xì)胞，其中染色體正常胎兒孕婦外周血中平均胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)為8個(1～12個)，而在染色體非整倍體胎兒孕婦外周血中胎兒有核紅細(xì)胞數(shù)平均為35個(7～113個)。

有學(xué)者[22]比較了FACS和MACS對胎兒有核紅細(xì)胞的富集效率，樣本采集自孕婦選擇終止妊娠后1 h內(nèi)的外周靜脈血，其中FACS采用γ-珠蛋白抗體，而MACS依次采用CD45和γ-珠蛋白兩種抗體篩選策略，純化的細(xì)胞經(jīng)FISH分析確認(rèn)細(xì)胞來源。結(jié)果顯示，MACS方法對胎兒有核紅細(xì)胞有更高的特異性，在后續(xù)的FISH分析中細(xì)胞丟失較少；而FACS富集胎兒有核紅細(xì)胞的富集效率更高，純度也更高；同時，MACS操作時間短，花費低，而FACS需要昂貴的設(shè)備和專業(yè)人員。2002年，一項多中心臨床研究[23]比較了兩種檢測策略的優(yōu)劣，MACS對目標(biāo)細(xì)胞的富集效率更高，對胎兒性別的鑒定準(zhǔn)確性也更高。

4. 微流控技術(shù)(microfluidics)：該技術(shù)采用高靈敏度的微流控設(shè)備，利用細(xì)胞自身形狀、大小和變形性等固有特征來分離目標(biāo)細(xì)胞。整個分離過程不需要抗體，并且效率較高。其用于血液組分的提取最初是為了獲得血漿或白細(xì)胞[24]。2008年，Huang等[25]采用微流控技術(shù)在58例孕婦外周血中分離出胎兒有核紅細(xì)胞，其中在37例普通妊娠中獲得經(jīng)鑒定的有核紅細(xì)胞平均是37.7個/毫升(0.37～168.2個/毫升)，在21例非整倍體胎兒妊娠中獲得的有核紅細(xì)胞平均是37.2個/毫升(0.99～274.36個/毫升)，有核紅細(xì)胞產(chǎn)量約為MACS或SBA親和素分選法的10～20倍；作者雖然能夠去除99.99%的白細(xì)胞，但白細(xì)胞在最終富集樣本中仍有8 000～80 000個/毫升。2010年Lee等[26]采用第3代微流控技術(shù)對模擬樣本中胎兒有核紅細(xì)胞回收率為74.0%，成熟紅細(xì)胞去除46.5%。但是在實際應(yīng)用的效果還未見報道。最近，有學(xué)者[27]采用兩步法分離有核紅細(xì)胞，第一步利用紅細(xì)胞的高度聚集性富集包含有有核紅細(xì)胞和白細(xì)胞的混合產(chǎn)物，第二步利用微流控技術(shù)分離出有核紅細(xì)胞，并采集18例孕婦外周血驗證該技術(shù)的實際效果；結(jié)果顯示，每毫升外周血樣本處理后可以得到1～396個有核紅細(xì)胞和0～6個白細(xì)胞，有核紅細(xì)胞純度為20%～100%。

5. 親和素分離法：有核紅細(xì)胞表面含有大量的半乳糖基，而大豆凝集素(soybean agglutinin，SBA)具有半乳糖特異性凝集作用，可選擇性黏附有核紅細(xì)胞，從而達到分離的目的。有學(xué)者[28]采集了131例孕6～27周的孕婦外周血，先經(jīng)密度梯度離心，再采用該技術(shù)處理，在96%的孕婦外周血中分離到有核紅細(xì)胞，平均2.3 ml外周血中可得到(7.8±8.5)個有核紅細(xì)胞；FISH技術(shù)檢測8例孕有男胎的孕婦血樣，顯示超過一半的有核紅細(xì)胞為胎兒來源。2005年，Babochkina等[29]研究了SBA親和素分離法和MACS從孕婦外周血中分離有核紅細(xì)胞的效率，顯示前者分離的細(xì)胞數(shù)比后者高約8倍，并且對細(xì)胞形態(tài)影響小，易于辨認(rèn)和分析；但富集細(xì)胞中混有大量母體細(xì)胞，胎兒有核紅細(xì)胞純度明顯低于MACS法。最近，有研究[30]對該技術(shù)進行了改進，孕婦外周血經(jīng)密度梯度離心后，采用CD45抗體去除淋巴細(xì)胞，之后與半乳糖特異性凝集素連接固定在玻片上，染色后經(jīng)自動成像分析對細(xì)胞進行分類；所有39例樣本中均可鑒別出有核紅細(xì)胞，10 ml血液中可識別出18～6 000個；在14例男胎的血樣分離標(biāo)本中，F(xiàn)ISH檢測可見10個或以上的有核紅細(xì)胞來源于胎兒。

6. 單細(xì)胞顯微操作分離法：二十世紀(jì)九十年代中期，有學(xué)者[31]采用顯微操作的方法分離有核紅細(xì)胞，并且在大部分樣本中準(zhǔn)確鑒定出胎兒性別，開創(chuàng)了無創(chuàng)產(chǎn)前診斷的新途徑。之后，Sekizawa等[32]采用密度梯度離心結(jié)合顯微操作的方法獲得胎兒有核紅細(xì)胞，進一步用引物延伸預(yù)擴增(primer extension preamplification , PEP)的方法對單個有核紅細(xì)胞進行全基因組擴增，確定細(xì)胞來源于胎兒后，對可能懷有DMD胎兒的孕婦進行了產(chǎn)前診斷。這項技術(shù)同樣適用于其他X-連鎖遺傳病的產(chǎn)前診斷。有研究[33]應(yīng)用類似技術(shù)，檢測了13例孕婦的胎兒RhD血型，準(zhǔn)確率為12/13。但該技術(shù)僅局限于對男性胎兒進行診斷。之后，有學(xué)者[18]將顯微操作技術(shù)與多重PCR技術(shù)相結(jié)合，在單細(xì)胞層面研究孕婦外周血中有核紅細(xì)胞的來源，結(jié)果顯示胎兒來源的約占一半。單細(xì)胞顯微操作法不僅能獲得單個胎兒細(xì)胞，還可對明確為胎源性的細(xì)胞進行遺傳分析，因此，避免了孕婦外周血細(xì)胞的污染問題。

7. 納米材料與特異性抗體相結(jié)合：近年來，隨著材料科學(xué)的發(fā)展，納米材料與傳統(tǒng)技術(shù)相融合，在各項研究中的應(yīng)用日益增多。2016年，武漢大學(xué)He等研究人員[34]以羥基磷灰石/殼聚糖納米顆粒(HA/CTS NPs)在玻璃基質(zhì)上構(gòu)建3D納米結(jié)構(gòu)芯片，可顯著增加與修飾抗體(CD147)接觸面積，從而提升FNRBCs捕獲效率，平均每毫升孕婦外周血捕獲25個胎兒有核紅細(xì)胞；同時由于納米芯片的良好透光性，可以原位進行FISH檢測和染色體非整倍體分析；采用該技術(shù)處理10例生育男孩的孕婦外周血，分離出的FNRBCs經(jīng)三色免疫熒光染色(ε-HbF，CD71，DAPI)鑒定8例為男性，而采用FISH鑒定9例為男性；對胎兒染色體非整倍體的診斷，則準(zhǔn)確診斷出7例(4例21-三體，3例13-三體)。2017年初，有學(xué)者[35]采用類似納米技術(shù)從孕婦外周血中分離胎兒有核紅細(xì)胞，該方法首先經(jīng)過Percoll 1.077 單密度梯度離心，以玻璃為載體的納米羥基磷灰石基底上修飾CD147抗體，對孕婦外周血中的胎兒有核紅細(xì)胞進行捕獲，利用HbF、CD71 以及DAPI 對有核紅細(xì)胞進行標(biāo)記，實現(xiàn)分選目的；對10 例孕婦外周血樣本，均成功分離出胎兒有核紅細(xì)胞，然后經(jīng) FISH 鑒定，該方法對男胎診斷的靈敏度為 85.7%(6/7)，特異度為100%，對女胎診斷的靈敏度為100%，并準(zhǔn)確診斷出 1 例21-三體胎兒。

二、胎兒有核紅細(xì)胞(FNRBC)的鑒定和應(yīng)用

經(jīng)過上述各種方法富集純化的有核紅細(xì)胞，并不都是胎兒來源。有研究顯示，自孕婦外周血富集純化的有核紅細(xì)胞中，大約22～50%來源于母親[21]。因此，在將純化的有核紅細(xì)胞用于產(chǎn)前檢測前，必須鑒定其為胎源性或母源性。目前常用的方法有：(1)特異性探針FISH分析或?qū)染色體特異序列行PCR擴增，但該方法只能鑒定來源為男胎的有核紅細(xì)胞；(2)免疫標(biāo)記的胚胎型珠蛋白法，包括ε-，ζ-，和γ-珠蛋白。有研究表明，ε-珠蛋白在孕早期更適合做為胎兒有核紅細(xì)胞的標(biāo)志物[36, 37]。

胎兒有核紅細(xì)胞經(jīng)鑒定后可以作為產(chǎn)前檢測的遺傳物質(zhì)來源，采用相應(yīng)的分子生物學(xué)技術(shù)檢測疾病。FISH能準(zhǔn)確分析胎兒性別和染色體異常，PCR可分析單基因遺傳病。Price等[18]首次報道了利用胎兒有核紅細(xì)胞鑒定胎兒性別和診斷胎兒非整倍體，之后，F(xiàn)ISH技術(shù)在胎兒非整倍體的檢測中廣泛展開。有學(xué)者自孕婦外周血中分離出胎兒有核紅細(xì)胞，PCR后檢測，診斷鐮狀細(xì)胞貧血和β-地中海貧血各一例[38]。Nagy等[39]分離得到胎兒有核紅細(xì)胞后利用QF-PCR檢測胎兒核型，與羊水穿刺結(jié)果比較，符合率為78.6%(11/14)。隨著單細(xì)胞全基因組擴增技術(shù)的逐漸成熟，相信會有更多的遺傳性疾病可通過孕婦外周血中的胎兒細(xì)胞得到確診。

三、小結(jié)

總之，孕婦外周血中分離富集胎兒有核紅細(xì)胞的方法眾多，這已成為產(chǎn)前檢測和遺傳學(xué)研究領(lǐng)域的熱點，并取得了部分進展。但分離富集技術(shù)與臨床推廣應(yīng)用之間還有一定差距，各項技術(shù)或操作繁瑣，費時費力；或分離效率不高，細(xì)胞純度不夠；不能滿足臨床實際需求。因此，目前的研究應(yīng)著重在優(yōu)化分離富集策略，尋找胎兒有核紅細(xì)胞特異性分子標(biāo)志物，并提高自動化分析水平，滿足臨床大規(guī)模應(yīng)用，從而真正實現(xiàn)無創(chuàng)產(chǎn)前診斷。

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