姚 荷，譚興和*，張春艷，王 鋒，李清明，王欄樹，成才良

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410128；3.湖南佳宴食品有限公司，湖南 長沙 410000）

亞硝酸鹽（nitrite，NIT）廣泛存在于食品中，因其發(fā)色、保持風(fēng)味、抗氧化和抑制致病菌生長等特性，經(jīng)常被用作食品添加劑。但過量攝入亞硝酸鹽會引發(fā)機(jī)體中毒、高鐵血紅蛋白癥和癌變等[1]。據(jù)調(diào)查，超過80%的硝酸鹽和亞硝酸鹽攝入與蔬菜及其相關(guān)制品有關(guān)，其中發(fā)酵蔬菜尤甚[2-3]。蔬菜發(fā)酵是以蔬菜為原料、利用有益微生物活動，并控制一定生產(chǎn)條件進(jìn)行蔬菜保藏的一種方式，在我國已有上千年的歷史。其制品品種多樣、風(fēng)味獨(dú)特、營養(yǎng)豐富，具有促消化、抑菌、抗老化等功效[4-5]。傳統(tǒng)蔬菜發(fā)酵多為自然發(fā)酵，利用蔬菜、水、發(fā)酵材料自身所帶乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵[6]。但自然發(fā)酵品質(zhì)不一、發(fā)酵周期長、雜菌較多，存在亞硝酸鹽含量超標(biāo)的現(xiàn)象，嚴(yán)重危害人體健康。為解決這些問題，目前多采用人工接種乳酸菌進(jìn)行蔬菜發(fā)酵。乳酸菌在蔬菜發(fā)酵中起主導(dǎo)作用，因其不帶有硝酸還原酶，被認(rèn)為是無毒、無害的益生菌。通過乳酸菌發(fā)酵，不僅可以改善發(fā)酵環(huán)境、縮短發(fā)酵周期、抑制雜菌生長、促進(jìn)腸道蠕動以及營養(yǎng)吸收[7-8]，還可顯著降低發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽含量，彌補(bǔ)自然發(fā)酵的缺陷[9-10]。JI F D等[11]研究表明，接種乳酸菌發(fā)酵白菜相比自然發(fā)酵，亞硝酸鹽含量及其峰值明顯降低。本文就發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的來源、乳酸菌降解亞硝酸鹽的途徑以及影響發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的因素進(jìn)行了探討，并對今后實(shí)際生產(chǎn)中，利用發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽研究趨勢進(jìn)行了展望。

1 發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽的來源及危害

蔬菜經(jīng)自身氮循環(huán)、過量施用氮肥、田間采收貯藏等累積了大量的硝酸鹽。硝酸根離子具有較低的急性毒性，但在長期貯藏和發(fā)酵過程中，經(jīng)硝酸還原菌的作用，可轉(zhuǎn)化為具有較高急性毒性的亞硝酸鹽[12-13]。人體在食用剛腌制或不新鮮的蔬菜時(shí)，會導(dǎo)致亞硝酸鹽攝入過量，繼而引發(fā)機(jī)體中毒，出現(xiàn)頭暈無力、胸悶氣短、惡心腹瀉等癥狀，嚴(yán)重者會呼吸衰竭，危及生命[14]。且大量具有強(qiáng)氧化性的亞硝酸鹽進(jìn)入血液后會改變血紅蛋白正常形態(tài)，造成高鐵血紅蛋白癥；也會干擾人體對維生素A的吸收，導(dǎo)致血脂下降，心跳過速等；并在人體內(nèi)經(jīng)一系列代謝活動生成致癌性極強(qiáng)的亞硝基化合物[15]，增加了胃癌、嬰兒畸型的風(fēng)險(xiǎn)[16-17]。成人攝入0.3～0.5g亞硝酸鹽即可引起中毒，攝入3g會導(dǎo)致死亡。操作不規(guī)范、衛(wèi)生條件差的發(fā)酵蔬菜中多存在亞硝酸鹽含量超標(biāo)的現(xiàn)象，這嚴(yán)重制約了發(fā)酵蔬菜行業(yè)的發(fā)展。2012年，世界衛(wèi)生組織（world health organization，WHO）已將發(fā)酵蔬菜列入致癌物質(zhì)清單中[18]。2017年，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在二類致癌物清單中公布，在導(dǎo)致內(nèi)源性亞硝化條件下攝入的硝酸鹽或亞硝酸鹽屬2A類致癌物。國標(biāo)GB 2762—2017《食品中污染物限量》規(guī)定，蔬菜及其制品中腌漬蔬菜所含亞硝酸鹽的限量不得超過20 mg/kg[19]。

2 發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的機(jī)理

發(fā)酵初期，發(fā)酵液中含有的氧使雜菌迅速生長繁殖，產(chǎn)生的硝酸還原酶將發(fā)酵蔬菜中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，致使亞硝酸鹽含量急劇增加[20]。乳酸菌在蔬菜發(fā)酵過程中會代謝產(chǎn)生乳酸、酒石酸和亞硝酸還原酶等[21]，使發(fā)酵環(huán)境的pH下降，從而抑制酶活和雜菌生長[22-23]。亞硝酸還原酶和酸性環(huán)境（pH＜4.0）是發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽降解的主要原因，此外，乳酸菌產(chǎn)生的細(xì)菌素也在其中起著重要作用。

2.1 酶降解

乳酸菌在蔬菜發(fā)酵的過程中會產(chǎn)生大量的代謝產(chǎn)物，其中就包括亞硝酸還原酶。研究表明，亞硝酸還原酶可有效的降解亞硝酸鹽。張慶芳等[24]對乳酸菌降解亞硝酸鹽機(jī)理進(jìn)行了研究，得知在發(fā)酵前期，發(fā)酵液的pH＞4.5時(shí)，乳酸菌對亞硝酸鹽的降解以亞硝酸鹽還原酶降解為主。張馨月等[25]用電子捕獲-氣相色譜（electron capture-gas chromatography，EC-GC）法和靛酚藍(lán)染色法確定亞硝酸鹽的降解途徑，并通過測定干酪乳桿菌鼠李糖亞種（Lactobacillus caseisubsp.rhamnosus）6013細(xì)胞中不同組分的酶活研究了亞硝酸鹽還原酶的定位。實(shí)驗(yàn)中，隨著NaNO2的降解，產(chǎn)物中產(chǎn)生N2O氣體，沒有NH4+。表明LCR 6013能有效降解亞硝酸鹽是源于細(xì)胞內(nèi)亞硝酸鹽還原酶的作用，最可能通過反硝化路徑NO2-→NO→N2O→N2進(jìn)行降解，而非銨化作用。亞硝酸還原酶大多是胞間酶，其降解亞硝酸鹽的效果極易受到溫度和pH的影響。龔鋼明等[26]在研究乳酸桿菌（Lactobacillus）C2亞硝酸鹽還原酶制備時(shí)，對酶學(xué)性質(zhì)的分析表明，亞硝酸鹽還原酶最適溫度30℃，最適pH 5.5，在低于30℃和酸性環(huán)境中，酶活受到抑制，但仍保留活性，但在50℃以及堿性環(huán)境中時(shí)，酶活性消失。盧海強(qiáng)等[27]從自然發(fā)酵的酸菜樣品中獲得1株高產(chǎn)亞硝酸還原酶的冷明串珠菌（Leuconostoc gelidum）R11，并經(jīng)過發(fā)酵特性的初步研究表明，該菌最適生長溫度為20℃，且能夠在較低的溫度條件下正常生長，能夠滿足酸菜低溫發(fā)酵需求。此外，其還擁有較好的產(chǎn)酸能力。蔬菜發(fā)酵環(huán)境的多變會影響乳酸菌和亞硝酸鹽還原酶的活性，繼而影響發(fā)酵前期亞硝酸鹽降解效果，因此篩選抗逆性強(qiáng)的產(chǎn)亞硝酸鹽還原酶的乳酸菌對蔬菜發(fā)酵產(chǎn)業(yè)至關(guān)重要。

2.2 酸降解

蔬菜發(fā)酵過程中，乳酸菌利用糖類代謝產(chǎn)生大量酸，發(fā)酵環(huán)境的pH不斷降低[28]，使得亞硝酸鹽還原酶的活力下降，亞硝酸鹽的降解由酶降解轉(zhuǎn)為酸降解。YANG H等[29]研究表明，酸菜發(fā)酵12 d后pH值由7.3降至4.0，之后保持在pH4.1左右；發(fā)酵第6天出現(xiàn)亞硝峰，之后亞硝鹽含量不斷降低，其中6～18 d尤甚。因此可知，當(dāng)pH降至5.5（第6天）后，亞硝酸鹽降解以酸降解為主。林浩[30]利用不同pH的乳酸溶液，觀察植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對亞硝酸鹽的降解效果。發(fā)現(xiàn)當(dāng)溶液初始pH值＞5.0時(shí)，亞硝酸鹽降解率在24 h內(nèi)＜20%，降解效果不顯著。當(dāng)溶液初始pH≤4.0時(shí)，亞硝酸鹽含量下降明顯，其中初始pH為3.0時(shí)，亞硝酸鹽含量下降速率很快，在24 h后降解率可達(dá)87.29%，降解效果良好。此結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)液中pH≤4.0時(shí)，植物乳桿菌對亞硝酸鹽的降解以酸降解為主。李春等[31]分析乳酸菌降解亞稍酸鹽的可能機(jī)制，觀察到乳酸桿菌發(fā)酵至pH≤4.0時(shí)，亞硝酸鹽含量下降急劇加快，當(dāng)達(dá)到發(fā)酵終pH 3.6時(shí)，亞硝酸鹽降解率接近100%。從此結(jié)果可初步判定，乳酸菌降解亞硝酸鹽過程中，酸可能是引起亞硝酸鹽降解的主要因素，且當(dāng)pH≤4.0時(shí)，酸降解效果尤為明顯。酸性發(fā)酵環(huán)境抑制了雜菌的生長繁殖和硝酸還原酶的活力，且H+與亞硝酸鹽發(fā)生非酶歧化反應(yīng)，這些都促使了亞硝酸鹽含量的降低。因此，在滿足發(fā)酵蔬菜色、香、味的前提下，適當(dāng)降低發(fā)酵初期pH是減少亞硝酸鹽含量的有效方式。

2.3 乳酸菌素

乳酸菌素是由乳酸菌核糖體產(chǎn)生并分泌到胞外的一類抗菌肽，能抑制一些親緣關(guān)系相近的細(xì)菌，其可防止食品腐敗和致病菌的生長，繼而降低蔬菜發(fā)酵過程中硝酸還原酶活性和亞硝酸鹽含量[32]。乳酸菌素被認(rèn)為是食品的天然保護(hù)劑[33-34]，目前，乳酸鏈球菌素（nisin）是應(yīng)用最廣泛的乳酸菌素[35]。JIANG J等[36]從中國傳統(tǒng)發(fā)酵蘿卜中分離到一株產(chǎn)細(xì)菌素的新菌株清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei）LSJ618，其產(chǎn)生的一種脂蛋白可抑制食品腐敗菌和食源性致病菌的生長，包括革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌（Staphlococcus aureus）、李斯特氏菌（Listeria）和革蘭氏陰性菌變形桿菌（Proteus）、大腸桿菌（Escherichia coli），但并沒有抑制大多數(shù)乳酸菌。此細(xì)菌素耐酸、耐低溫，且在發(fā)酵過程中降解較少，可用作生物防腐劑。韓新鋒等[37]以產(chǎn)細(xì)菌素植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）P158純種半固態(tài)發(fā)酵制作什錦泡菜，并與傳統(tǒng)自然發(fā)酵泡菜對比發(fā)現(xiàn)，接種發(fā)酵泡菜中細(xì)菌數(shù)、霉菌、大腸菌群數(shù)量均顯著低于自然發(fā)酵泡菜，乳酸菌活菌數(shù)量明顯高于自然發(fā)酵泡菜，其中，接種發(fā)酵泡菜發(fā)酵過程中pH值下降最迅速、亞硝酸鹽含量低于自然發(fā)酵，且無明顯亞硝酸鹽高峰。由此可知，乳酸菌素可抑制發(fā)酵蔬菜中有害菌生長，并間接降低了發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量。LIU W L等[38]對接種產(chǎn)細(xì)菌素Y31的屎腸球菌（Enterococcus faecium）Y31發(fā)酵白菜和自然發(fā)酵白菜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，接種Y31的白菜發(fā)酵速度更快、乳酸菌群數(shù)量更多、細(xì)菌素Y31產(chǎn)量更高、雜菌數(shù)量更少，且發(fā)酵液中亞硝酸根一直保持較低含量。因此，產(chǎn)細(xì)菌素Y31的屎腸球菌Y31作為一株安全菌株，與自然發(fā)酵相比，可有效地控制腐敗和病原微生物，降低亞硝酸鹽濃度，維持發(fā)酵蔬菜安全。

3 影響發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的因素

蔬菜在發(fā)酵過程中，乳酸菌對亞硝酸鹽降解情況受諸多因素影響，因此，可通過調(diào)節(jié)這些影響因素來控制亞硝酸鹽降解率，以得到安全美味的發(fā)酵蔬菜。

3.1 原材料

發(fā)酵開始前，體系中原材料及添加物會影響蔬菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量。閆亞梅等[39]以大白菜為主料，測定了不同蔬菜組合（白蘿卜、胡蘿卜、黃瓜、豇豆）自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量變化，發(fā)現(xiàn)亞硝峰的變化范圍為12～60 mg/kg，蔬菜種類越多，亞硝峰越低，即大白菜＋豇豆＋白蘿卜＋胡蘿卜＋黃瓜組合，亞硝峰最低是13mg/kg。食鹽可以調(diào)節(jié)發(fā)酵蔬菜口感、抑制細(xì)菌生長。熊濤等[40]以添加了2g/100mL、5g/100mL、8g/100mL食鹽的自然發(fā)酵泡菜為研究對象，比較了不同食鹽添加量的泡菜中優(yōu)勢菌系結(jié)構(gòu)和亞硝酸鹽含量的變化，發(fā)現(xiàn)乳酸菌是泡菜發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，2 g/100 mL食鹽的泡菜中乳酸菌的繁殖最快；5 g/100 mL食鹽能較好地抑制有害微生物的繁殖，最快出現(xiàn)亞硝峰，1 d即可穩(wěn)定；而8 g/100 mL食鹽抑制了泡菜中乳酸菌的繁殖，延遲了泡菜的成熟期。糖類的加入為乳酸菌發(fā)酵蔬菜提供碳源，同時(shí)也可成就發(fā)酵蔬菜的風(fēng)味。高潔榮等[41]研究了不同濃度綿白糖（0、2%、4%、6%、8%）對白菜自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響。結(jié)果表明，當(dāng)添加4%的綿白糖時(shí)發(fā)酵白菜的亞硝峰最早出現(xiàn)、最快達(dá)到穩(wěn)定且亞硝酸鹽含量最低，感官品質(zhì)最佳。

3.2 發(fā)酵條件

乳酸菌最適溫度為30～40℃，最適pH為5.5～6.5，因此發(fā)酵溫度和pH都影響乳酸菌降解亞硝酸鹽情況。田陳聃等[42]以甘藍(lán)為原料，研究不同發(fā)酵溫度（10℃、20℃、30℃）對自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響，發(fā)現(xiàn)30℃時(shí)，亞硝峰出現(xiàn)的最早且峰值大，然后下降至3個(gè)發(fā)酵溫度中最低。蘇肖晶[43]在MRS培養(yǎng)基中研究了溫度、pH值、乳酸菌接種量對乳酸菌降解亞硝酸鹽含量的影響，發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，亞硝酸鹽的降解率逐漸增加，35℃降解效果最好，之后溫度升高降解率開始下降；pH值在5.5時(shí)，亞硝酸鹽降解效果最好，pH＜4.5條件下，對亞硝酸鹽的降解作用降低，說明此pH下，乳酸菌活性受到抑制；隨接菌量的增加，亞硝酸鹽降解率也逐漸增加，說明增加發(fā)酵體系中乳酸菌量可以提高亞硝酸鹽的降解量。柴政等[44]研究了添加不同濃度食醋（0、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%）對泡白菜中微生物數(shù)量和亞硝酸鹽含量的影響。結(jié)果表明，相比不加食醋的泡白菜，加入食醋的泡白菜中乳酸菌數(shù)較高，腸道菌數(shù)低且總體呈下降趨勢，至第6天基本消失，亞硝峰低且變化不明顯。說明食醋能抑制亞硝酸鹽生成菌的生長繁殖，并加快乳酸菌降解亞硝酸鹽速度，促進(jìn)泡白菜的成熟。

4 展望

亞硝酸鹽廣泛存在于發(fā)酵蔬菜中，對人體健康危害極大，乳酸菌降解亞硝酸鹽是一種安全的生物降解法。因此，尋找能夠快速降解亞硝酸鹽、加速發(fā)酵蔬菜成熟且抗逆性強(qiáng)的乳酸菌是一個(gè)重要的研究方向。使用更快速、準(zhǔn)確的新設(shè)備追蹤蔬菜發(fā)酵過程中乳酸菌與亞硝酸鹽降解具體聯(lián)系及代謝產(chǎn)物對發(fā)酵體系的具體影響，如更多種乳酸菌素的研究發(fā)現(xiàn)。目前對于發(fā)酵蔬菜中乳酸菌降解亞硝酸鹽的研究只是實(shí)驗(yàn)室小規(guī)?；芯浚瑧?yīng)逐漸將其轉(zhuǎn)變成大型工廠化生產(chǎn)，滿足生產(chǎn)需求。