全 莉，馬文瑞，王雪薇，王舸楠，蒲秋蓮，宋 鈺，武 運(yùn)*，薛 潔

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司酒類品質(zhì)與安全國(guó)際聯(lián)合研究中心，北京 100015；3.吐魯番市質(zhì)量與計(jì)量檢測(cè)所，新疆 吐魯番 838000）

赭曲霉毒素是曲霉屬和青霉屬的某些菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，包括A、B、C、D（α）四種化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似的化合物，其中，赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）在自然界中最常見、毒性最強(qiáng)，對(duì)人類和動(dòng)物的健康威脅最大[1]。OTA在許多食品和飲料（如葡萄酒和葡萄汁）中普遍存在[2]，OTA對(duì)多種動(dòng)物具有腎臟毒性、肝臟毒性、免疫毒性、致畸毒性和致癌性[3]，被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for research on cancer，IARC）定為2B類致癌物[4]。OTA易溶于極性有機(jī)溶劑和碳酸氫鈉溶液，微溶于水；OTA具有熱穩(wěn)定性，加工過程只能去除一小部分的OTA，甚至在250℃高溫條件下都不能完全降解[5]。1995年，ZIMMERLI B等[6]首次在葡萄酒和葡萄汁中發(fā)現(xiàn)含有OTA，目前OTA已被認(rèn)為是葡萄及其深加工產(chǎn)品中主要真菌毒素[7]。

鑒于OTA的潛在危害，2002年歐盟對(duì)人們?nèi)粘ｏ嬍持袛z取的OTA情況進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查結(jié)果發(fā)現(xiàn)除谷物及谷物產(chǎn)品外，葡萄酒是人們攝取OTA的主要來源[8]，因此2005年1月1日歐盟規(guī)定了葡萄酒以及用于飲料制作的葡萄汁中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)為2.0 μg/L[9]；國(guó)際葡萄與葡萄酒組織（international vine and wine organization，OIV）也推薦葡萄酒中OTA的最大限量為2.0 μg/L[10]。我國(guó)于2017年3月17日發(fā)布的國(guó)標(biāo)GB 2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》中同樣對(duì)赭曲毒素（OTA）做出規(guī)定，該規(guī)定限制葡萄酒中OTA含量低于2 μg/L并于2017年9月17日生效，可見葡萄酒質(zhì)量控制尤其是葡萄酒OTA含量的控制已經(jīng)成為亟待解決的問題[11]。

研究表明，葡萄酒中的OTA問題主要與葡萄原料是否感染真菌病害有關(guān)，OTA含量的高低取決于葡萄酒的類型、原產(chǎn)地以及采收時(shí)間[12]。一般來講。由于釀酒工藝的差異，紅葡萄酒中OTA含量顯著高于白葡萄酒和桃紅葡萄酒[13]。釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)緯度越低，葡萄酒中的OTA含量也相對(duì)比較高，這主要由于氣候、葡萄栽培方式和貯存條件不同所致[14]。目前葡萄酒中OTA檢測(cè)主要有高效液相法（high performanceliquidchromatography，HPLC）和酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）[15]。HPLC法所用儀器昂貴、對(duì)樣品的預(yù)處理步驟復(fù)雜、檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)。ELISA法因具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、適于大批量樣品檢測(cè)的特點(diǎn)被采用。新疆是中國(guó)釀酒葡萄十大產(chǎn)區(qū)之一，具有種植優(yōu)質(zhì)釀酒葡萄得天獨(dú)厚的地理資源優(yōu)勢(shì)，自古以來就是中國(guó)主要的釀酒葡萄及葡萄酒產(chǎn)地，而作為西部產(chǎn)區(qū)，目前有關(guān)新疆葡萄酒中OTA含量的研究還比較少，生產(chǎn)過程中又缺乏嚴(yán)格的產(chǎn)品質(zhì)量保證措施，產(chǎn)品質(zhì)量安全有待提升，因此跟蹤生產(chǎn)中潛在安全影響因素是保證新疆葡萄酒質(zhì)量安全的控制要素。本研究建立了分析OTA的快速檢測(cè)方法，并對(duì)新疆葡萄酒中的OTA含量現(xiàn)狀進(jìn)行了調(diào)查分析，跟蹤了生產(chǎn)過程中OTA含量的變化規(guī)律，以期為提升新疆葡萄酒質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄酒樣品（32種）：來自新疆天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四大產(chǎn)區(qū)酒莊的葡萄原酒；甲醇（色譜純）、OTA液體標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：上海安普試驗(yàn)科技股份有限公司；2-16N高速微量離心機(jī)：湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司；鹽酸、氯化鈉（均為分析純）：北京化工廠；AgraQuant赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫試劑盒：北京集束科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204電子天平：梅特勒-托利多公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀：上海天能科技有限公司；VORTEX-S渦旋振蕩器：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；PHS-3C雷磁pH計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)液的制備

準(zhǔn)確移取10 mg/L OTA標(biāo)準(zhǔn)液1 mL至100 mL容量瓶中，用甲醇定容，得到100 μg/L的OTA儲(chǔ)備液，置于-20℃避光保存。

1.3.2 AgraQuant赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)方法

準(zhǔn)確移取3 mL葡萄酒樣品至一個(gè)檢測(cè)試管中，加入5.7 mL無水甲醇，渦旋振蕩30 s，用1 mol/L NaOH或HCl將pH值調(diào)至6.5～7.5。吸取200 μL酶聯(lián)偶合物至稀釋孔，加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品或樣品提取液至稀釋孔，充分混合后移取100μL至有抗體包被的微孔里，室溫條件下放置10 min，用去離子水清洗5次，拍干微孔板，吸取100 μL底物至每個(gè)微孔中，室溫條件下放置5 min，吸取100 μL終止液至每個(gè)微孔板，用酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)450 nm濾鏡及波長(zhǎng)630 nm示差濾鏡下讀取結(jié)果。

1.3.3 新疆葡萄酒中OTA的含量分析

（1）新疆葡萄酒中OTA含量的分析

考察了32種新疆葡萄酒樣品（白葡萄酒14種，紅葡萄酒18種）中OTA含量。

（2）新疆四大產(chǎn)區(qū)紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析考察了新疆四大產(chǎn)區(qū)（焉耆盆地、吐哈盆地、伊犁河谷、天山北麓）葡萄酒中OTA含量。

（3）葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化研究

對(duì)新疆某葡萄酒企業(yè)工業(yè)化釀造期間（白葡萄：霞多麗；紅葡萄：美樂）葡萄酒中OTA進(jìn)行全方位的跟蹤測(cè)定，研究OTA在葡萄酒釀造各個(gè)過程中的變化情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法有效性的驗(yàn)證

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

配制OTA標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度分別為0、2 μg/L、5 μg/L、20 μg/L和40 μg/L，按上述試驗(yàn)條件處理，以質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)值（lg Conc.）為橫坐標(biāo)，吸光度值差值的對(duì)數(shù)值（B為吸光度值，Bo為零點(diǎn)吸光度值）為縱坐標(biāo)繪制OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖1。

圖1 酶聯(lián)免疫法法檢測(cè)OTA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of OTA analysis by enzyme-linked immunoassay

由圖1可知，OTA在0～40 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為y=-1.243 5x+0.918 8，R2=0.998 9。

2.1.2 精密度試驗(yàn)

在5份3 mL空白葡萄酒樣品中，分別添加100 μg/L的OTA標(biāo)品儲(chǔ)備液60μL，使葡萄酒樣品中OTA含量為2μg/L，重復(fù)測(cè)定5次，結(jié)果見表1。由表1可知，試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)差（relative standard deviation，RSD）為3.54%，表明該方法精密度良好。

表1 OTA檢測(cè)精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of precision tests for OTA determination

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

在2份3mL空白葡萄酒樣品中，分別添加30μL、60μL、150 μL 100 μg/L的OTA標(biāo)品儲(chǔ)備液，使葡萄酒樣品中OTA含量為1μg/L、2μg/L、5μg/L，在兩個(gè)不同的日期進(jìn)行測(cè)定，比較差異，以評(píng)價(jià)方法的穩(wěn)定性，結(jié)果見表2。

表2 OTA檢測(cè)重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of repeatability tests for OTA determination

由表2可知，重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.34%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

在5份3mL空白葡萄酒樣品中，分別添加30μL、60μL、120μL、180μL、240μL100μg/L的OTA標(biāo)品儲(chǔ)備液，使葡萄酒樣品中OTA含量為1 μg/L、2 μg/L、4 μg/L、6 μg/L、8 μg/L，每個(gè)水平作5次平行試驗(yàn)，計(jì)算平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

表3 OTA檢測(cè)加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of adding standard recovery rates for OTA determination

由表3可知，添加標(biāo)品范圍為1～8 μg/L時(shí)，平均回收率為97.07%～111.00%，RSD均＜10%，說明該方法的準(zhǔn)確度符合要求。

2.2 新疆葡萄酒中OTA含量的分析

2.2.1 新疆葡萄酒中OTA含量的分析

圖2 新疆葡萄酒中OTA檢出樣品含量分析Fig.2 Analysis of OTA content in Xinjiang wine

32種葡萄酒樣品中，18種樣品（56.25%）檢出OTA，14種樣品（43.75%）未檢出OTA。檢出OTA的樣品中OTA含量分析結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，檢出OTA的葡萄酒有9種樣品的OTA含量在0～0.5 μg/L；6種樣品的OTA含量在0.5～1.0 μg/L；3種樣品的OTA含量在1.0～1.5μg/L；所有樣品的OTA含量均未超過GB2761—2017《食品中真菌毒素限量》規(guī)定的2μg/L，說明新疆地區(qū)葡萄酒中的OTA是符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的。

2.2.2 新疆四大產(chǎn)區(qū)紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析

考察了新疆四大產(chǎn)區(qū)白葡萄酒與紅葡萄酒中OTA的平均含量，結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同產(chǎn)區(qū)紅葡萄酒和白葡萄酒中OTA含量分析Fig.3 Analysis of OTA content in red and white wines from different producing areas

由圖3可知，檢測(cè)到OTA的樣品中，紅葡萄酒有12種，白葡萄酒有6種，且紅葡萄酒中的OTA含量顯著高于白葡萄酒，這主要是由于紅葡萄酒是帶皮發(fā)酵，而白葡萄酒是清汁發(fā)酵，葡萄生長(zhǎng)期間感染霉菌產(chǎn)生的OTA均在葡萄皮中，因此發(fā)酵前的清洗工藝有助于降低葡萄酒中的OTA含量。

其次，產(chǎn)區(qū)不同，葡萄酒中的OTA含量也不同，本研究中焉耆盆地和吐哈盆地產(chǎn)區(qū)葡萄酒中OTA檢出量較低，平均含量分別為0.19μg/L、0.20μg/L，而伊犁河谷和天山北麓產(chǎn)區(qū)葡萄酒中OTA檢出量較高，平均含量分別為0.46μg/L、0.60μg/L，根據(jù)資料報(bào)道，焉耆盆地和吐哈盆地的年平均降雨量不足100 mm[16]，這也說明了葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候條件與OTA污染密切相關(guān)。

2.3 葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化研究

對(duì)新疆某葡萄酒企業(yè)工業(yè)化釀造期間葡萄酒中OTA進(jìn)行全方位的跟蹤測(cè)定，研究OTA在葡萄酒釀造各個(gè)過程中的變化情況，測(cè)定結(jié)果如圖4所示。

由圖4A可知，白葡萄酒釀造過程中，OTA含量呈顯著的下降趨勢(shì)，從初始的0.047 6 μg/L下降至發(fā)酵結(jié)束前的0.001 4 μg/L，下降了97.06%，其中下降幅度最大的是發(fā)酵前葡萄汁的澄清過程，下降了51.68%，而發(fā)酵前葡萄汁整個(gè)處理過程OTA含量的下降了89.08%，因此說明了澄清劑對(duì)控制葡萄酒中的OTA含量至關(guān)重要。

圖4 白（A）、紅（B）葡萄酒生產(chǎn)過程中OTA含量的變化情況Fig.4 Variation of OTA content in red(A)and white(B)wines during production process

由圖4B可知，紅葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化規(guī)律不同于白葡萄酒，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在葡萄酒滿罐循環(huán)后至加酵母前，由于葡萄皮渣與葡萄汁充分接觸，為了浸提單寧、色素和其他風(fēng)味物質(zhì)，OTA也隨之浸提到發(fā)酵葡萄汁中，從而導(dǎo)致發(fā)酵醪液中較高的OTA含量[17]。紅葡萄酒釀造過程中OTA含量從初始的0.022 μg/L增加至加酵母前的0.097 μg/L，增加了104.5%。而添加酵母后，葡萄酒中OTA含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，主要原因有兩點(diǎn)：一是酵母的降解作用[18]；其次是由于酵母細(xì)胞壁的負(fù)電荷的吸附機(jī)制，以及OTA的酸性特點(diǎn)[19]，隨后在澄清過程被去掉。

3 討論

近年來，國(guó)內(nèi)外對(duì)OTA的研究越來越多，酶聯(lián)免疫法（ELISA）已成為小麥、玉米等谷物OTA含量檢測(cè)的常用方法，時(shí)瑾等[20]采用ELISA方法檢測(cè)小麥樣品中的OTA，方法回收率為95%～110%，方法重現(xiàn)性良好，變異系數(shù)小于10%。本試驗(yàn)回收率為97.07%～111.00%，RSD＜10%，說明采用ELISA方法檢測(cè)OTA對(duì)葡萄酒進(jìn)行測(cè)定，該方法能夠達(dá)到GB 2761—2017《食品中真菌毒素限量》中方法的檢測(cè)限，并且該方法有準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、無復(fù)雜的前處理的優(yōu)點(diǎn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)紅葡萄酒中OTA含量高于白葡萄酒，與康健對(duì)葡萄酒中赭曲霉毒素的研究一致[21]，這可能和葡萄酒的釀造工藝有關(guān)。GAMBUTI A等[22]研究了葡萄酒釀造工藝對(duì)葡萄酒中OTA含量的影響，研究認(rèn)為澄清和過濾可以降低其含量；FERNANDES A等[23]的研究顯示，在浸漬過程中OTA的含量開始升高，在液固分離時(shí)，OTA大部分隨皮渣流失。本試驗(yàn)結(jié)果與GAMBUTI A等[22]的研究結(jié)果一致，葡萄酒釀造浸漬過程中OTA含量會(huì)有所升高，但大部分OTA會(huì)隨著皮渣被除去，最終葡萄酒中OTA含量很低。原因可能是在發(fā)酵過程中，OTA結(jié)合在葡萄蛋白質(zhì)和酵母細(xì)胞壁上，因此去除皮渣時(shí)，絕大多數(shù)OTA可以隨著皮渣被除去。

4 結(jié)論

建立了試驗(yàn)室酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)飲料酒中OTA含量的方法，該方法的精密度試驗(yàn)結(jié)果RSD為3.54%，回收率為97.07%～111.00%，精密度及準(zhǔn)確度符合要求。該方法可以滿足OTA的定量分析。

本試驗(yàn)所檢測(cè)的32種葡萄酒樣品中，18種樣品（56.25%）檢出OTA，14種樣品（43.75%）未檢出OTA，所有樣品的OTA含量均未超過國(guó)標(biāo)2 μg/L，說明新疆地區(qū)葡萄酒中OTA含量是符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的。

天山北麓、伊犁河谷、焉耆盆地和吐哈盆地四個(gè)產(chǎn)區(qū)的葡萄酒中OTA含量存在差異性，大多數(shù)紅葡萄酒中OTA含量高于白葡萄酒，焉耆盆地和吐哈盆地葡萄酒OTA含量（平均含量為0.19 μg/L、0.20 μg/L）低于天山北麓和伊犁河谷（平均含量為0.46 μg/L、0.60 μg/L），而焉耆盆地和吐哈盆地又是溫度較高降雨量較少的產(chǎn)區(qū)，這也說明了葡萄產(chǎn)區(qū)和葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候條件與OTA污染密切相關(guān)。

白葡萄酒釀造過程中，OTA含量呈顯著的下降趨勢(shì)，下降幅度最大的是發(fā)酵前葡萄汁的澄清過程。然而紅葡萄酒釀造過程中OTA含量的變化規(guī)律不同于白葡萄酒，呈先升高后降低的趨勢(shì)，在葡萄酒滿罐循環(huán)后至加酵母前這個(gè)期間，為了浸提單寧、色素和其他風(fēng)味物質(zhì)，葡萄皮渣中的OTA也隨之浸提到發(fā)酵葡萄汁中，而添加酵母后，OTA又呈下降趨勢(shì)。