楊曉軍, 馬 娜， 李 麗, 張少華

(1.延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安 716000；2.陜西省化學(xué)反應(yīng)工程重點實驗室， 陜西 延安 716000)

隨著人們生活水平的不斷提高，大棚蔬菜栽培面積不斷增加。由于棚內(nèi)溫度高、濕度大、光照較弱、空氣流動緩慢等特殊的生態(tài)環(huán)境，致使蔬菜易遭受病蟲危害。目前防治蔬菜病害主要依賴化學(xué)農(nóng)藥，但長期施用化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果逐步降低，同時還造成環(huán)境污染，危害人畜安全[1]。生物農(nóng)藥具有與環(huán)境相容性高、對人畜安全等特點，越來越引起人們的關(guān)注。放線菌次生代謝產(chǎn)物中往往具有一類或幾類抗生素，且大部分選擇性強，已成為生物農(nóng)藥的研發(fā)方向[2-3]。鏈霉菌作為放線菌門中種類最多的一個屬，是產(chǎn)生各類抗生素的主要來源[4-5]，鏈霉菌產(chǎn)生的抗生素可以特異性地作用于某些病原菌，降低其生長和繁殖速度，進(jìn)而降低病害發(fā)生的頻率[6]。近年來，病原菌耐藥性的增強導(dǎo)致發(fā)現(xiàn)新抗菌化合物的機率減少，已引起科學(xué)界的高度重視。研究發(fā)現(xiàn)，極端環(huán)境中可能存在產(chǎn)生獨特次級代謝產(chǎn)物的放線菌類群，這些特殊的種群為微生物天然產(chǎn)物的研究開發(fā)提供了新的資源[7-8]。極端環(huán)境的特殊性導(dǎo)致長期生存的微生物與普通自然環(huán)境下生存的有所不同，長期的生存壓力使其形成了獨特的環(huán)境適應(yīng)模式、特殊的生理代謝機制和獨特的基因類型，可以產(chǎn)生多種獨特的生物活性物質(zhì)，不僅在自然界物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮重要作用，而且成為一類重要的生物資源[9]。近年來課題組在篩選農(nóng)用抗生素生物資源過程中，從陜西省綏德縣鹽堿土壤中分離得到1株灰色鏈霉菌(編號YD3309)，該菌菌絲體提取物對多種蔬菜病原菌具有抑制作用。為明確其活性成分，本研究采用活性跟蹤法對其化學(xué)成分進(jìn)行分離純化。結(jié)果從中分離到2個活性化合物，利用波譜學(xué)數(shù)據(jù)并與文獻(xiàn)對照確定這2個活性化合物的結(jié)構(gòu)分別為新刺孢霉素A(1)和N-乙?；贝?2)，2個化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。本研究采用菌絲生長速率法測定2個代謝產(chǎn)物的抑菌活性，結(jié)果報告如下。

圖1 2個化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structures of two compounds

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 實驗菌株分離自陜西省綏德縣鹽堿土壤，由延安大學(xué)生命科學(xué)院鄧振山副教授利用16S rRNA 基因序列分析法鑒定為灰色鏈霉菌Streptomycesgriseus；供試菌為番茄灰霉病菌(Botrytiscinerea)、茄子黃萎病菌(Verticilliumdahliae)、辣椒枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、白菜黑斑病菌(Altemabrassicae)、黃瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.cucumerinum)、油菜菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)和番茄早疫病菌(Alternariasolani)7種指示菌，均由延安市農(nóng)科所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基(g/L) 種子培養(yǎng)基：淀粉24， 葡萄糖1，蛋白胨3，牛肉膏3， 酵母膏5，CaCO34， 水1 000 mL，pH 8.0，28 ℃培養(yǎng)48 h；發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆粉20，蛋白胨2，葡萄糖20，淀粉5，酵母膏2，NaCl 4，K3PO40.5，CaCO32，水1 000 mL， pH 8.0，28 ℃培養(yǎng)144 h。

1.1.3 儀器及試劑 XRC-1型顯微熔點儀；IR Prestige-21紅外光譜儀(日本島津公司)；AV-500 型核磁共振儀 (瑞士Bruker公司)；MAT-711型質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；Vario EL有機元素分析儀(德國Elementar公司)；1525型HPLC (Waters公司)；Sephadex LH-20 (Pharmacia產(chǎn)品)；柱層析硅膠100～200目(青島海洋化工廠產(chǎn)品)。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵方法 將已活化好的菌株轉(zhuǎn)接到種子培養(yǎng)基內(nèi)，28 ℃、300 r/min 搖床培養(yǎng)48 h，得到種子液。菌體從種子瓶接種于發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，接種量為1∶10，置于28 ℃、300 r/min搖床培養(yǎng)144 h。發(fā)酵總量為40 L。

1.2.2 活性成分的分離與結(jié)構(gòu)鑒定 將發(fā)酵144 h的發(fā)酵液40 L, 以3 000 r/min離心，得上清液和菌絲體兩部分。菌絲體用丙酮浸泡，超聲波輔助提取，將丙酮提取液減壓濃縮，獲得棕色粗浸膏509.1 g, 粗樣品用水溶解，溶解部分用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液經(jīng)濃縮后得到浸膏163.2 g, 此浸膏用硅膠(200～300目)柱層析分離,以V(石油醚)∶V(氯仿 )=20∶1→18∶1→16∶1→14∶1→12∶1→10∶1→8∶1→6∶1→4∶1 梯度洗脫，結(jié)合活性跟蹤，收集得到兩個有效組分A和B。將A和B兩個組分繼續(xù)用Sephadex LH-20凝膠柱進(jìn)一步純化，并用HPLC檢測其純度，最后得到2個化合物1(102 mg)和2(89 mg)。采用IR、1HNMR、13CNMR和ESI-MS等技術(shù)，結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)對化合物1和2進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析。

1.2.3 抗菌活性測定 ①單體化合物對病原真菌的抑制作用：將兩個單體化合物用二甲亞砜(DMSO)溶解后，滅菌水稀釋至100 mg/L的溶液，將5 μL測試液加入到滅菌后冷卻至40 ℃的PDA培養(yǎng)基中，充分搖勻。以等體積的二甲亞砜加入到PDA培養(yǎng)基中作為空白對照，分別倒入直徑為60 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)制成平板，備用。培養(yǎng)基凝固后，在每個培養(yǎng)皿中央用接菌針接入供試病原菌菌餅(直徑為5 mm)，將平板置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3 d，測量菌落直徑，每個樣品重復(fù)平行3次，菌落直徑測量3次求平均值，用下式計算抑菌率：菌落凈生長直徑=測量直徑-5 mm，抑菌率(%)=((對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑)×100%。②半抑菌濃度(IC50)的測定：選用兩單體化合物抑菌效果明顯的病原菌為供試菌株，進(jìn)行毒力測定。將兩種單體化合物樣品采用倍半稀釋法，分別配成含樣品質(zhì)量濃度為100、50、25、12.5和6.25 mg/L的溶液進(jìn)行抑菌活性實驗。以濃度對數(shù)—抑菌率幾率值求出毒力回歸線。根據(jù)曲線求出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 化合物1 白淡黃色粉末狀固體，m. p. 263.2～264.5 ℃；由ESI-MS: (m/z) 322 [M-H]-,推出該化合物的分子量為323，分子量為奇數(shù)，故分子式中含有奇數(shù)個氮原子；從元素分析得知碳、氫和氮的百分含量分別為70.59%、6.51%和12.96%；質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為C19H21N3O2；IR(KBr) νmaxcm-1: 3 356、 3 258 (N-H伸縮振動), 3 068 (Ar-H伸縮振動), 1 679(酰胺羰基伸縮振動), 1 624 (碳-碳雙鍵伸縮振動),905(RCH=CH2碳-碳雙鍵面外彎曲振動)。1HNMR (CDCl3,500 MHz)δ:8.31(1H, s, H-1),7.46(1H,br.s,H-11)，7.35(1H, d,J=7.0, H-4), 7.26 (1H, d,J=7.5, H-7), 7.20 (1H, s, H-8),7.16 (1H, dd,J= 7.5,7.2Hz, H-6), 7.14(1H,dd,J=7.2,7.0 Hz,H-5),6.38 (1H, br.s, H-14), 6.05 (1H,dd,J=16.8, 9.7 Hz, H-17), 5.22 (1H, d,J=9.7Hz, H-18α),5.16(1H, d,J=16.8 Hz, H-18β), 4.28 (1H, qd,J=6.8,1.5Hz, H-12), 1.59 (3H, d,J=6.8 Hz, H-15), 1.51 (6H, s, H-19, 20);13CNMR(CDCl3,125 MHz)δ: 165.8(C-13),160.0(C-10),144.5(C-17),143.8(C-2),134.1(C-3a), 125.9 (C-7a),124.3(C-3), 122.1(C-6), 120.9 (C-5),118.8(C-7), 113.1(C-18), 111.7 (C-8), 111.3(C-4), 102.6 (C-9), 51.4(C-12), 39.0 (C-16), 27.3 (C-19),27.0(C-20), 20.6 (C-15)。其理化數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)對照基本一致[10-11]，故鑒定為新刺孢曲霉素A。

2.1.2 化合物2 白色固體，m.p.132.5～134.6 ℃。ESI(+)-MS: (m/z) 233 [M+H]+, 255[M +Na]+; 487 [2M+Na]+, 得出該化合物的分子量為232,從元素分析得知碳、氫和氮的含量分別為67.21%、6.88%和12.07%；質(zhì)譜結(jié)合元素分析提示該化合物的分子式為C13H16N2O2；IR (KBr) νmaxcm-1: 3 402 (N-H, 伸縮振動), 3 285 (-OH伸縮振動), 1 639(酰胺C=O伸縮振動);1HNMR (DMSO-d6, 500 MHz) δ: 7.69 (1H, d,J= 8.2 Hz,H-4), 7.35(1H, d,J=8.0 Hz,H-7), 7.11 (1H,dd,J=8.2,7.8 Hz, H-6),7.08(1H,s,H-2),7.02(1H,dd,J=8.2,7.8 Hz, H-5), 4.22(1H,m, H-9),3.59(1H,d,J=6.0 Hz,H-10α),3.54(1H,d,J=12.6 Hz, H-10β),3.03(1H,dd,J=13.2,6.5 Hz,H-8α),2.90(1H,dd,J=13.2,6.5 Hz,H-8β),1.85(3H,s,H-13);13CNMR(DMSO-d6,125 MHz)δ:173.8(C-12),138.1(C-7a),130.0(C-3a),124.6(C-2),122.1(C-6),120.1(C-4,C-5),112.5(C-3),112.1(C-7),64.1(C-10),53.8(C-9),28.1(C-8),23.1(C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道的N-乙?；贝紨?shù)據(jù)一致，故化合物2為N-乙?；贝?。

2.2 兩種化合物的抗菌活性

由表1可以看出，兩個化合物濃度為100 mg/L時，對7種供試蔬菜病原菌均有一定的抑制效果，但對不同病原菌抑制效果存在較大差別。其中化合物1對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌菌絲具有強烈的抑制作用，抑制率分別為91.2%和90.6%；化合物2對茄子黃萎病菌的菌絲具有強烈的抑制作用，抑制率為90.2%。進(jìn)一步對其毒力測定結(jié)果表明，化合物1對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌的IC50值分別為30.6和28.8 mg/L，化合物2對茄子黃萎病菌的IC50值為34.3 mg/L(表2)。

表1 二種化合物對7種蔬菜病原菌的抑制作用

注：表中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值，表2同

表2 兩種化合物對供試菌的毒力

3 討 論

本研究從1株灰色鏈霉菌的菌絲體中分離得到兩個屬于echinulin家族的吲哚類生物堿，利用波譜學(xué)數(shù)據(jù)鑒定其結(jié)構(gòu)為新刺孢霉素A(1)和N-乙?；贝?2)，化合物1首次從放線菌中分離得到。有文獻(xiàn)報道這類化合物具有清除自由基、改善記憶、抑制細(xì)胞增殖和抗細(xì)菌等多種生理活性[13-17]，但尚未報道此類化合物具有抗蔬菜病原菌的作用。本研究采用菌絲生長速率法測定了兩單體化合物對7種蔬菜病原菌的抑菌活性，結(jié)果表明，在100 mg/L的濃度下，兩單體化合物對7種供試蔬菜病原菌均有一定的抑制作用，但對不同病原菌抑制效果有較大差異?；衔?對番茄灰霉病菌和番茄早疫病菌具有強烈的抑制作用，化合物2對茄子黃萎病菌具有強烈的抑制作用，抑制率均達(dá)90%以上。

盡管在實驗室條件下，兩個單體化合物分別對番茄灰霉病菌、番茄早疫病菌和茄子黃萎病菌具有強烈的抑制作用，但棚內(nèi)或田間生態(tài)環(huán)境較為特殊，所以，兩單體化合物在棚內(nèi)和田間的防病效果有待于進(jìn)一步試驗研究。

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