劉文婷， 張 寧

(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 第二風(fēng)濕免疫科，遼寧 沈陽 110004)

瘧疾是當(dāng)今對(duì)人類危害最為嚴(yán)重的三大感染性疾病之一，WHO最新報(bào)告顯示，瘧疾的感染率和發(fā)病率仍然居高不下，再感染或重復(fù)感染在流行區(qū)屢見不鮮[1]。除與抗原變異相關(guān)外，機(jī)體未能產(chǎn)生持久的免疫記憶或許是導(dǎo)致這一現(xiàn)象發(fā)生最主要因素[2]。因此，探明影響瘧疾免疫記憶建立與維持的相關(guān)因素則具有極為重要的現(xiàn)實(shí)意義。樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell, DC)是唯一能夠活化初始 T 細(xì)胞的專職抗原遞呈細(xì)胞，也是連接固有和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁細(xì)胞。Toll樣受體 (Toll like receptor，TLR)是DC識(shí)別瘧原蟲抗原的主要模式識(shí)別受體，其表達(dá)水平和強(qiáng)度可直接介導(dǎo)DC對(duì)效應(yīng)性細(xì)胞活化的調(diào)控[3]，進(jìn)而影響免疫記憶的建立與維持[4]。盡管有資料顯示，記憶性T細(xì)胞在抵御再感染過程中發(fā)揮舉足輕重的作用[5-6]，但有關(guān)TLR9激動(dòng)劑是否能直接促進(jìn)瘧疾記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生和持續(xù)存在卻少有報(bào)道。鼠瘧模型因重復(fù)性好、可操作性強(qiáng)已成為抗瘧免疫發(fā)生機(jī)制研究的首選模型。我國(guó)流行的主要瘧疾蟲種是間日瘧，其生物學(xué)特征與非致死型約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii17XNL，P.y17XNL)具有一定相似性[7]。為此，利用TLR9激動(dòng)劑處理的P.y17XNL 鼠瘧模型，通過分析再感染狀況與再感染前后脾細(xì)胞中記憶性和活化性CD4+T細(xì)胞的百分率及其相關(guān)效應(yīng)分子分泌水平之間的關(guān)系，進(jìn)一步明確TLR9激動(dòng)劑對(duì)瘧疾記憶性T細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠和瘧原蟲 BALB/c小鼠，雌性，1.5～2月齡(中科院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，腹腔感染P.y17XNL寄生的紅細(xì)胞(1×106個(gè))；感染前2 d，小鼠經(jīng)脛骨前肌肉分別注射CpGl826和CpGl982(對(duì)照)，50 μg/只。90 d后，用1×106個(gè)P.y17XNL寄生的紅細(xì)胞對(duì)小鼠進(jìn)行第二次感染。

1.1.2 脾細(xì)胞采集與培養(yǎng) 無菌條件下處死正常、CpGl826注射及其對(duì)照組小鼠，摘取脾臟， 200目篩網(wǎng)上研磨，用含5%(體積分?jǐn)?shù))FCS的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液制成懸液，350 g離心10 min，紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，10%(體積分?jǐn)?shù))FCS的RPMI 1640懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×107/mL，待后續(xù)染色與檢測(cè)。用24孔培養(yǎng)板對(duì)部分脾細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，每孔加脾細(xì)胞懸液500 μL，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，-80 ℃保存收集的培養(yǎng)上清，待IFN-γ和IL-10檢測(cè)。

1.1.3 主要試劑與儀器 CpGl826、T細(xì)胞的各種標(biāo)記抗體和細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒分別購自Takara公司、BD Pharmingen公司和R&D Systems公司，酶標(biāo)檢測(cè)儀和流式細(xì)胞儀分別購自InterMed公司和BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠感染狀態(tài)觀察 感染不同時(shí)間點(diǎn)的小鼠經(jīng)尾尖取血，涂薄血膜，吉姆薩染色10 min，顯微鏡下觀察紅細(xì)胞感染狀態(tài)。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 按說明書操作程序，用細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和IL-10水平。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處OD值，以標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用SoftMaxPro 4.3.1Ls軟件分析計(jì)算細(xì)胞因子含量(pg/mL)。

1.2.3 記憶性和活化性T細(xì)胞檢測(cè) 在0.1 mL待測(cè)脾細(xì)胞懸液中加入FITC-conjugated anti-mouse CD4 mAb、APC-conjugated anti-mouse CD62L mAb和PE-conjugated anti-mouse CD45RO mAb用以記憶性T細(xì)胞檢測(cè)；而加入FITC-conjugated anti-mouse CD4 mAb和PE-conjugated anti-mouse CD69 mAb用以活化性T細(xì)胞檢測(cè)。4 ℃避光染色30 min，以含1% (體積分?jǐn)?shù))FCS的PBS洗滌2次，用500 μL含2%(體積分?jǐn)?shù))多聚甲醛的PBS固定懸浮，流式細(xì)胞分析儀檢測(cè)，利用FlowJo7.6.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 數(shù)據(jù)經(jīng)t- test，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 TLR9激動(dòng)劑對(duì)蟲血癥水平的影響

初次感染后3 d可見瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，隨后感染率逐漸增加，感染后13 d TLR9激動(dòng)劑處理組和對(duì)照組的感染率達(dá)到峰值，分別為10.82%和12.25%，但前者感染15 d后下降較快，90%小鼠于感染后19 d自愈(圖1A)；二次感染后，TLR9激動(dòng)劑處理組和對(duì)照組的10只鼠中分別有5只(50%)和7只(70%)出現(xiàn)瘧原蟲感染的紅細(xì)胞，其峰值感染率分別為0.64%和0.82%(圖1B)。這表明，TLR9激動(dòng)劑對(duì)控制初次感染后期蟲血癥水平以及降低再感染發(fā)生率和紅細(xì)胞感染率均具有一定作用。

圖1 初次感染紅細(xì)胞感染率(A)和二次感染紅細(xì)胞感染率(B)Fig.1 The erythrocyte infection rate at different time points after primary infection(A) and reinfection(B) with P.y17XNL

2.2 TLR9激動(dòng)劑對(duì)活化性T細(xì)胞的影響

細(xì)胞免疫是抵御再感染重要因素之一。圖2顯示，二次感染前，TLR9激動(dòng)劑處理組與對(duì)照組小鼠脾CD4+T細(xì)胞中活化性CD4+T細(xì)胞百分率分別為2.88%和3.02%，感染后1 d，兩組均出現(xiàn)了明顯升高(*P<0.01)，分別達(dá)到6.62%和5.04%，但前者升高幅度比對(duì)照組更為顯著(#P<0.05)，感染后3 d也顯示同樣趨勢(shì)。這表明TLR9激動(dòng)劑對(duì)再感染的細(xì)胞免疫應(yīng)答具有一定促進(jìn)作用。

圖2 P.y17XNL再感染0 、1 和3 d活化性CD4+T細(xì)胞百分率Fig.2 The percentage of actived T cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL *: 與二次感染前同組小鼠相比P<0.01；#: 與對(duì)照組小鼠相比P<0.05*: P<0.01 when compared with pre-reinfection mice in the same group；#: P<0.05 when compared with control mice

2.3 TLR9激動(dòng)劑對(duì)記憶性T細(xì)胞的影響

再感染后活化性T細(xì)胞百分率迅速升高可能與其體內(nèi)存在的記憶性T細(xì)胞數(shù)量具有一定相關(guān)性。圖3顯示，再感染前TLR9激動(dòng)劑處理組及對(duì)照組的記憶性CD4+T細(xì)胞百分率分別為12.98%和10.16%，再感染后3 d分別達(dá)到16.52%和14.44%，均出現(xiàn)了明顯升高(*P<0.05)。在每一檢測(cè)時(shí)點(diǎn)TLR9激動(dòng)劑處理鼠的水平均高于對(duì)照組。這表明，TLR9激動(dòng)劑對(duì)初始感染細(xì)胞免疫記憶的維持和再感染免疫記憶的提高均有一定促進(jìn)效應(yīng)。

圖3 P.y17XNL再感染0、1 和3 d記憶性CD4+T細(xì)胞百分率Fig.3 The percentage of memory T cells on day of 0, 1 and 3 after reinfection with P.y17XNL

2.4 TLR9激動(dòng)劑對(duì)細(xì)胞因子分泌水平的影響

細(xì)胞因子分泌水平是反映T細(xì)胞活化程度的主要標(biāo)志。圖4顯示，再感染前脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中TLR9激動(dòng)劑處理組及對(duì)照組的IFN-γ水平分別為106.3 pg/mL和83.46 pg/mL，IL-10分別為88.08 pg/mL和77.16 pg/mL；再感染后1 d兩組的 IFN-γ水平均明顯升高(*P<0.01)，分別達(dá)到372.74 pg/mL和216.17 pg/mL；再感染后3 d 的IL-10分別達(dá)到479.84 pg/mL和394.26 pg/mL，也均出現(xiàn)了顯著升高(*P<0.01)。盡管沒有組間差異，TLR9激動(dòng)劑處理組每一檢測(cè)點(diǎn)IFN-γ水平和再感染后第3天的IL-10水平均高于對(duì)照組。這表明TLR9激動(dòng)劑可使再感染小鼠首先快速建立Th1反應(yīng)，而后又產(chǎn)生了一定水平的Th2反應(yīng)。

圖4 P.y17XNL再感染不同時(shí)點(diǎn)IFN-γ和IL-10水平Fig.4 The levels of IFN-γ and IL-10 at different time points after reinfection with P.y17XNL

3 討 論

有文獻(xiàn)報(bào)道，在抵御靈長(zhǎng)類瘧原蟲再感染過程中，CD4+T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是不可或缺的因素[6]；流行病學(xué)調(diào)查也顯示，惡性瘧原蟲感染者，若能產(chǎn)生高水平IFN-γ，既可降低再感染的發(fā)生率，又可明顯延遲再感染的發(fā)生時(shí)間[8]；間日瘧原蟲感染可促進(jìn)記憶性CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生，并以此抵御再感染的發(fā)生[5]。由此表明，機(jī)體抵御瘧疾再感染的發(fā)生主要依賴于持久性免疫記憶的存在。

DC對(duì)T細(xì)胞的應(yīng)答強(qiáng)度以及促炎性和抗炎性細(xì)胞因子分泌水平的調(diào)控直接影響免疫記憶的建立和維持[3-4]，而DC實(shí)現(xiàn)對(duì)T細(xì)胞的激活效應(yīng)主要取決于TLR的存在，作為多受體家族的一員，TLR9主要識(shí)別瘧原蟲的DNA和瘧色素[9]。在TLR9介導(dǎo)下，DC完成對(duì)瘧原蟲抗原的內(nèi)化，上調(diào)多種表面分子表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控CD4+T細(xì)胞的分化。實(shí)驗(yàn)表明，TLR9缺陷鼠不能建立有效的Th1應(yīng)答[10]；TLR9激動(dòng)劑可上調(diào)促炎性細(xì)胞因子和下調(diào)抗炎性細(xì)胞因子分泌[11]，而記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生又明顯取決于初始應(yīng)答強(qiáng)度[12]。這些結(jié)果提示，干預(yù)TLR9表達(dá)水平及活性或許可直接影響記憶性T細(xì)胞的產(chǎn)生。

研究顯示，外源性TLR9激動(dòng)劑不僅對(duì)控制初次感染后期蟲體血癥水平具有一定作用，同時(shí)可維持一定數(shù)量記憶性CD4+T細(xì)胞的持續(xù)存在；二次感染后，活化性CD4+T細(xì)胞數(shù)量迅速升高并分泌高水平Th1型細(xì)胞因子IFN-γ，進(jìn)而有效降低再感染發(fā)生率和蟲血癥水平；活化性T細(xì)胞短時(shí)間內(nèi)迅速增加除與一些初始T細(xì)胞活化有關(guān)外，更可能是其體內(nèi)存在的記憶性T細(xì)胞的迅速活化所致。有研究證明，瘧疾的長(zhǎng)期免疫保護(hù)主要依賴記憶性T細(xì)胞的持續(xù)存在，保護(hù)效應(yīng)強(qiáng)弱與記憶性T細(xì)胞的數(shù)量及功能密切相關(guān)，少許數(shù)量記憶性T細(xì)胞的存在也可明顯降低再感染的發(fā)生率[13]。這與我們的結(jié)果基本吻合。此外，我們的研究還顯示，當(dāng)IFN-γ達(dá)到峰值水平后，IL-10也出現(xiàn)有意義的升高，表明TLR9激動(dòng)劑可使宿主獲得更為協(xié)調(diào)的免疫調(diào)節(jié)功能。本研究從固有免疫應(yīng)答入手，證明了TLR9激動(dòng)劑對(duì)鼠瘧記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生和維持有一定促進(jìn)作用，這或許為瘧疾免疫干預(yù)策略的確立和疫苗方案的設(shè)計(jì)提供了一些新依據(jù)。

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