郭秋平，陳貴英，周 泉，金若敏

(1.廣州醫(yī)藥研究總院有限公司藥物非臨床評價研究中心，廣州 510240； 2.上海中醫(yī)藥大學藥物安全性評價中心，上海 201203)

苦參堿(matrine，MT)和氧化苦參堿(oxymatrine，OMT)是中藥苦參和山豆根主要成分和質量標準[1]?？鄥A和氧化苦參堿具有抗腫瘤、抗炎、抗乙肝病毒和抗肝纖維化作用以及鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜作用[2-6]，氧化苦參堿還表現(xiàn)出對心肌的保護作用[7-8]，臨床用于治療癌癥、慢性肝炎、肝纖維化和心肌病?？鄥A和氧化苦參堿藥效比較已有報道[9-10]，苦參堿的鎮(zhèn)痛作用優(yōu)于氧化苦參堿；苦參堿的抗炎作用小于氧化苦參堿。然而，關注苦參堿和氧化苦參堿毒性的研究很少，只有少數(shù)報道表明苦參堿和氧化苦參堿具有毒性[11-12]，但其毒性的比較、毒性特征和機制仍不清楚。

本研究首次使用體內(nèi)斑馬魚模型比較苦參堿和氧化苦參堿的肝臟毒性，并通過體外肝細胞模型進行驗證。本研究的目的是探索這些化合物的肝毒性嚴重程度、特征和初步毒性機制，為臨床使用和安全使用含苦參堿和氧化苦參堿的中藥提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗細胞與實驗動物

L-02肝細胞：香港大學饋贈；AB-line斑馬魚：南方醫(yī)科大學提供。

1.2 主要試劑與儀器

苦參堿(純度99.1%，批號130622)和氧化苦參堿(純度99.3%，批號130610)，上海榮和制藥有限公司提供；對乙酰氨基酚(acetaminophen，APAP)，廣州白云山藥業(yè)有限公司提供；MTT：美國Amersco；丙二醛(malondialdehyde，MDA)和谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒：南京建成生物工程公司；威廉姆斯培養(yǎng)基(WME)：美國Sigma。

酶標儀(ELX800，Biotek，美國)，生化分析儀(7100，Hitachi，日本)，熒光顯微鏡(BX51，Olympus，日本)，ABI7900HT序列檢測系統(tǒng)(AB公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 體外肝細胞模型毒性比較研究

(1)細胞培養(yǎng)與處理：將肝細胞以每平方厘米1 × 105個細胞接種在24孔板上進行培養(yǎng)。培養(yǎng)液為威廉姆斯培養(yǎng)基，含10%胎牛血清(FBS)，10 U/L胰島素鐵硒傳遞蛋白(ITS)，10 U/L地塞米松，4 × 107U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，5% CO2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)48 h。IC50檢測中，48 h后除對照孔外，加入對乙酰氨基酚32 mmol/L，苦參堿1、3、8、20 mmol/L，氧化苦參堿3、8、19 mmol/L，設5個復孔。其余試驗中，加入對乙酰氨基酚32 mmol/L，苦參堿3、8、20 mmol/L，氧化苦參堿3、8、19 mmol/L，設5個復孔。

(2)IC50檢測：24 h后，加入100 μL MTT孵育4 h后加入150 μL二甲基亞砜(DMSO)，振蕩孵育10 min，630 nm和490 nm檢測吸光度。計算抑制百分比：(D490-D630)/(D490-D630) × 100%，并計算IC50值。

(3)肝細胞酶檢測：24 h后，收集培養(yǎng)基，檢測谷丙轉氨酶(alanine transaminase，ALT)，谷草轉氨酶(aspartate aminotransferase，AST)，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)。

(4)肝細胞形態(tài)學檢查：采用細胞爬片技術制片。HE染色檢查肝細胞形態(tài)。肝細胞病理分級如下：①正常肝細胞具有完整的結構：“-”，0級；②肝細胞輕度腫脹：“+”，1級；③肝細胞中度腫脹：“++”，2級；④肝細胞嚴重腫脹和破裂：“+++”，3級；⑤肝細胞壞死：“++++”，4級。

(5)丙二醛和谷胱甘肽含量測定：24 h后，用1.8 g/L胰蛋白酶消化，收集細胞并懸浮于低滲Tris緩沖液中，4000 r/min離心10 min。收集上清液，檢測丙二醛和谷胱甘肽含量。

(6)肝細胞凋亡檢測：細胞爬片后，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌5 min，然后用DAPI染色20 min，檢測細胞凋亡。每個樣本隨機選5個區(qū)域計數(shù)凋亡細胞數(shù)，計算凋亡百分比：凋亡細胞數(shù)/細胞數(shù)× 100%。

1.3.2 體內(nèi)斑馬魚模型毒性比較研究

(1)斑馬魚飼養(yǎng)與處理：水溫為(23±1) ℃，pH為(7.8±1)，硬度250 mg/L，光照時間為12 h。實驗方案符合廣州醫(yī)藥研究總院有限公司動物福利與倫理委員會(EX-EL2012005-01)的要求。LC50試驗中，對乙酰氨基酚8 mmol/L，苦參堿0.26、0.32、0.40、0.50、0.63 mmol/L，氧化苦參堿3.8 mmol/L；其余試驗中，對乙酰氨基酚8 mmol/L，苦參堿0.26、0.40、0.63 mmol/L，氧化苦參堿3.8 mmol/L。

(2)LC50檢測：藥物處理后觀察動物的日常外觀、行為和采食情況。96 h后，快速冷凍將動物進行安樂死，計算LC50值。

(3)肝細胞形態(tài)學檢查：96 h后動物安樂死。取肝臟，石蠟切片，HE染色。檢查肝細胞形態(tài)。肝細胞病理分級如下：①正常肝細胞具有完整的結構：“-”，0級；②肝細胞輕度空泡化：“+”，1級；③肝細胞中度空泡化：“++”，2級；④肝細胞嚴重空泡化：“+++”，3級；⑤肝細胞壞死：“++++”，4級。

(4)丙二醛和谷胱甘肽含量測定：取斑馬魚肝臟勻漿，3000 r/min離心10 min。收集上清液檢測丙二醛和谷胱甘肽含量。

(5)肝細胞凋亡檢測：取肝臟石蠟切片，將切片脫蠟后，PBS中洗滌5 min，DAPI染色20 min，檢測肝細胞凋亡。檢測方法同體外肝細胞。

(6)氧化應激和凋亡相關基因檢測：取對照組和苦參堿(0.40 mmol/L)組斑馬魚肝臟。檢測基因zgc: 136383，zgc: 123120和EIF4EBP3的表達。PCR條件如下：95℃，5 min；95℃，10 s；60℃，30 s；使用2× QuantiFast SYBR Green PCR Master Mix進行40個循環(huán)。引物設計如下(5’→3’)：GAPDH-F：GTGACCCCTTTGCTGTTTCTTT，GAPDH-R：GGCAC GTGGTGCAAACATT；zgc136383-F：GTTCCCATCAA TCCAGACGGT，zgc136383-R：TGACAGTTCTGCATC AACACATC；EIF4EBP3-F：AAGAAAGCACATCAGAA CATAAA，EIF4EBP3-R：GAAATCCAGGCAAACGAA A；zgc123120-F：CCAGACACCTCCCCTCATT，zgc123120-R：CTCTCCAGCACAACTTCCC。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 體外肝細胞模型毒性比較研究

2.1.1 IC50檢測

結果顯示，對乙酰氨基酚(32 mmol/L)對肝細胞具有明顯的抑制作用，苦參堿和氧化苦參堿也具有明顯的抑制作用；苦參堿和氧化苦參堿的IC50值分別為5.3 mmol/L和> 19 mmol/L。因此，苦參堿對肝細胞的抑制作用明顯大于氧化苦參堿。

2.1.2 肝細胞酶檢測

結果顯示(表1)，對乙酰氨基酚(32 mmol/L)組細胞的ALT、AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01)；苦參堿(20 mmol/L)組細胞ALT、AST、ALP和LDH含量均升高(P< 0.01)，而苦參堿(8 mmol/L)組細胞僅ALP、LDH含量增加(P< 0.01)；氧化苦參堿(19 mmol/L)組細胞的AST、ALP和LDH含量增加(P< 0.01)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組細胞ALT、AST、ALP和LDH含量升高(P< 0.05或P< 0.01)。

表1 苦參堿和氧化苦參堿對肝細胞酶的影響

注：與對照組相比，*P< 0.05，**P< 0.01；與氧化苦參堿組相比，▲P< 0.05，▲▲P< 0.01。

Note. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the OMT group,▲P< 0.05,▲▲P< 0.01.

2.1.3 肝細胞形態(tài)學檢查

結果顯示(圖1)，對乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細胞數(shù)減少，肝細胞出現(xiàn)嚴重腫脹，有些細胞核消失(P< 0.05)；苦參堿(20 mmol/L)組肝細胞數(shù)減少，肝細胞呈輕度至中度腫脹(P< 0.05)；苦參堿(8 mmol/L)和氧化苦參堿(19 mmol/L)組的肝細胞輕度腫脹(P> 0.05)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細胞形態(tài)變化更嚴重(P< 0.05)。

注：A：對照組(-)；B：對乙酰氨基酚組(32 mmol/L)(+++)；C：苦參堿組(20 mmol/L)(-)；D：苦參堿組(8 mmol/L)(+++)；E：苦參堿組(3 mmol/L)(+)；F：氧化苦參堿組(19 mmol/L)(+)；G：氧化苦參堿組(8 mmol/L)(-)；H：氧化苦參堿組(3 mmol/L)(-)。圖1 苦參堿和氧化苦參堿對肝細胞形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.1 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the cultured liver cells. HE staining

2.1.4 肝細胞丙二醛和谷胱甘肽含量測定

結果顯示，對乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細胞丙二醛含量增加，谷胱甘肽含量降低(P< 0.05)；苦參堿(20 mmol/L)組肝細胞丙二醛含量增加(P< 0.05)，谷胱甘肽含量降低(P< 0.01)；苦參堿(8 mmol/L)(P< 0.05)和氧化苦參堿(19 mmol/L)(P< 0.01)組肝細胞谷胱甘肽含量也降低。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細胞的谷胱甘肽含量顯著降低(P< 0.01)。

2.1.5 肝細胞凋亡檢測

結果顯示(圖2)，對乙酰氨基酚(32 mmol/L)組肝細胞核的熒光密度增加，肝細胞凋亡百分比顯著增加(P< 0.05)；苦參堿(20、8 mmol/L)和氧化苦參堿(19 mmol/L)組部分肝細胞凋亡，凋亡百分比增加(P< 0.05)。與氧化苦參堿(19 mmol/L)相比，苦參堿(20 mmol/L)組肝細胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)。

注：A：對照組(-)；B：對乙酰氨基酚組(32 mmol/L)(+++)；C：苦參堿組(20 mmol/L)(-)；D：苦參堿組(8 mmol/L)(+++)；E：苦參堿組(3 mmol/L)(+)；F：氧化苦參堿組(19 mmol/L)(+)；G：氧化苦參堿組(8 mmol/L)(-)；H：氧化苦參堿組(3 mmol/L)(-)。圖2 苦參堿和氧化苦參堿對肝細胞凋亡的影響(DAPI染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (32 mmol/L) (+++); C: MT group (20 mmol/L) (-); D: MT group (8 mmol/L) (+++); E: MT group (3 mmol/L) (+); F: OMT group (19 mmol/L) (+); G: OMT group (8 mmol/L) (-); H: OMT group (3 mmol/L) (-).Fig.2 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the cultured liver cells. DAPI staining

2.2 體內(nèi)斑馬魚模型的毒性比較研究

2.2.1 LC50檢測

結果顯示，對乙酰氨基酚(8 mmol/L)對斑馬魚具有明顯的毒性?？鄥A(0.26～0.63 mmol/L)處理3 h后，斑馬魚出現(xiàn)游泳失衡和活動減少；濃度> 0.32 mmol/L引起死亡，LC50為0.41 mmol/L。氧化苦參堿(3.8 mmol/L)處理斑馬魚6 h后，斑馬魚出現(xiàn)游泳失衡和活動減少，但大多數(shù)在24 h后恢復；氧化苦參堿的LC50為> 3.8 mmol/L。

2.2.2 肝細胞形態(tài)學檢查

結果顯示(圖3)，對乙酰氨基酚(8 mmol/L)引起斑馬魚肝細胞輕度至嚴重空泡化(P< 0.05)；苦參堿(0.63 mmol/L)引起斑馬魚肝細胞輕度至嚴重空泡化(P< 0.05)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)組相比，苦參堿(0.63 mmol/L)組肝細胞形態(tài)學變化更為嚴重(P< 0.05)。

注：A：對照組；B：對乙酰氨基酚組(8 mmol/L)(+++)；C：氧化苦參堿組(3.8 mmol/L)(+)；D：苦參堿組(0.63 mmol/L)(++)；E：苦參堿組(0.40 mmol/L)(+)；F：苦參堿組(0.26 mmol/L)(-)。圖3 苦參堿和氧化苦參堿對斑馬魚肝細胞形態(tài)的影響(HE染色，× 400)Note. A: Control group (-); B: APAP group (8 mmol/L) (+++); C: OMT group (3.8 mmol/L) (+); D: MT group (0.63 mmol/L) (++); E: MT group (0.40 mmol/L) (+); F: MT group (0.26 mmol/L) (-).Fig.3 Effects of matrine and oxymatrine on morphology of the liver cells in zebrafish. HE staining

注：A：對照組；B：對乙酰氨基酚組(8 mmol/L)；C：氧化苦參堿組(3.8 mmol/L)；D：苦參堿組(0.63 mmol/L)；E：苦參堿組(0.40 mmol/L)；F：苦參堿組(0.26 mmol/L)。圖4 苦參堿和氧化苦參堿對斑馬魚肝細胞凋亡的影響(DAPI染色，× 400)Note. A: Control group; B: APAP group (8 mmol/L); C: OMT group (3.8 mmol/L); D: MT group (0.63 mmol/L); E: MT group (0.40 mmol/L); F: MT group (0.26 mmol/L).Fig.4 Effects of matrine and oxymatrine on apoptosis in the liver cells of zebrafish. DAPI staining

2.2.3 丙二醛和谷胱甘肽含量測定

結果顯示，對乙酰氨基酚(8 mmol/L)組肝細胞丙二醛含量明顯升高(P< 0.05)；苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組的丙二醛含量增加，而谷胱甘肽含量降低(P< 0.01或P< 0.05)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)相比，苦參堿(0.63 mmol/L)組肝細胞丙二醛含量明顯升高(P< 0.01)，谷胱甘肽含量明顯降低(P< 0.05)。

2.2.4 肝細胞凋亡檢測

表2 苦參堿對斑馬魚氧化應激和凋亡基因表達的影響

注：以對照組表達水平為1，分別對苦參堿組各目標基因的表達倍數(shù)進行校正。具體計算公式為：表達差(△△Ct)=苦參堿組Ct差-對照組Ct差，其中，Ct差(△Ct)=目標基因Ct值-內(nèi)參(GAPDH)Ct值，Ct值為實驗測得qPCR的循環(huán)數(shù)；表達倍數(shù)=2-△△Ct。與對照組相比，*P< 0.05。

Note. The expression level of each target gene in the control group was set as 1, and the expression fold in the MT group was normalized respectively. The specific formulas are as follows:△△Ct=△Ct of the MT group-△Ct of the control group;△Ct=Ct value of the target gene - Ct value ofGAPDH(as the internal control); Ct value refers to the qPCR cycles detected in this experiment. Relative folds to the control group=2-△△Ct. Compared with the control group,*P< 0.05,**P< 0.01.

結果顯示(圖4)，對乙酰氨基酚(8 mmol/L)組斑馬魚肝細胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)；苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組斑馬魚肝細胞凋亡率升高(P< 0.01)。與氧化苦參堿(3.8 mmol/L)組相比，苦參堿(0.63、0.40 mmol/L)組斑馬魚肝細胞凋亡率明顯升高(P< 0.05)。

2.2.5 氧化應激和凋亡相關基因檢測

結果顯示(表2)，苦參堿(0.40 mmol/L)組基因zgc: 136383下調(diào)至0.001(P< 0.05)，表明苦參堿誘導的氧化應激與zgc: 136383的下調(diào)相關?；騴gc: 123120上調(diào)至1.22(P< 0.05)，EIF4EBP3基因下調(diào)至0.02(P< 0.05)，說明苦參堿誘導的細胞凋亡與EIF4EBP3的下調(diào)和zgc: 123120的上調(diào)有關。

3 討論

本實驗采用人肝細胞作為體外模型保留人類的特征，保持肝細胞的生理和代謝特征，可以直接反映藥物的肝毒性。IC50值是衡量肝毒性的重要參數(shù)。與體外模型相比，斑馬魚模型可更準確地預測藥物毒性；此外，與哺乳動物模型相比，斑馬魚模型測試周期短，成本低和用藥量少，更符合動物福利倫理。因此，斑馬魚模型對于預測肝臟毒性是準確可靠的[13-14]。LC50是衡量化學物質在水中的毒性的重要參數(shù)。本研究預測試結果顯示，氧化苦參堿(3.8 mmol/L)處理并未引起斑馬魚死亡。根據(jù)ISO734561-3“物質對淡水魚的急性毒性的水質測定”，氧化苦參堿的毒性非常??；因此，正式試驗中氧化苦參堿的濃度為3.8 mmol/L。

本研究中，陽性對照藥對乙酰氨基酚對肝細胞和斑馬魚具有明顯的毒性作用。體外模型結果與體內(nèi)模型結果一致，表明本研究使用的系統(tǒng)穩(wěn)定可靠，可用于藥物評價。

本研究中，體外肝細胞模型表明苦參堿的毒性明顯大于氧化苦參堿?？鄥A和氧化苦參堿導致斑馬魚游泳不平衡，這可能與神經(jīng)毒性有關[15]，苦參堿對斑馬魚的毒性明顯大于氧化苦參堿。體內(nèi)外模型結果一致。

苦參堿(C15H24N2O)與氧化苦參堿(C15H24N2O2)結構相似?？鄥A是氧化苦參堿體內(nèi)的代謝產(chǎn)物之一?？鄥A注射后轉化率約為30%，氧化苦參堿僅為6%[16]?？鄥A在肝臟中的分布明顯高于氧化苦參堿[17]。這可能是苦參堿毒性明顯大于氧化苦參堿的原因。

本研究進一步探討了苦參堿和氧化苦參堿的初步肝毒性機制。大量研究表明肝毒性的主要機制是氧化應激和細胞凋亡[18-20]。因此，本研究中檢測到氧化應激和凋亡相關指標。丙二醛含量可反映身體脂質過氧化程度，間接反映細胞損傷程度[21-22]。谷胱甘肽含量映身體抗氧化能力的重要因素[23]。本研究表明其肝臟毒性機制與氧化應激相關?；騴gc: 136383的功能是參與脂質轉運調(diào)控，苦參堿使該基因表達下調(diào)，使脂質轉運功能受損，增加了細胞脂質積累，激活了氧化應激。

凋亡是一種細胞死亡形式[24]。DAPI可以通過細胞膜，與雙鏈DNA結合標記細胞核。凋亡發(fā)生時，染色質收縮聚集或進一步收縮形成顆粒，或細胞核分解形成碎片[25]。本研究表明肝毒性機制與細胞凋亡相關?；騴gc: 123120編碼一種Bcl-2家族/腺病毒相互作用蛋白，其與促凋亡基因結合以促進凋亡。基因EIF4EBP3編碼的蛋白是EIF4EBP家族的成員，作為蛋白激酶B的mTOR，激活蛋白激酶B并對線粒體凋亡途徑具有抗凋亡作用?？鄥A使基因EIF4EBP3表達下調(diào)，zgc: 123120表達上調(diào)，抗凋亡能力減弱，促凋亡能力增強，使肝細胞發(fā)生凋亡。

苦參堿是中藥山豆根和苦參的藥效和毒性物質基礎。本研究表明高劑量的苦參堿對肝臟有毒性，臨床使用大劑量的中藥苦參和山豆根時應考慮藥物的安全性。

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