劉 洋，韓倫英，何 川，彭鳳濤，李桂筑，王飛清*

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，貴陽 550001； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)學(xué)院，貴陽 550004)

中國是世界上最大的地方性氟中毒發(fā)病地帶，而貴州省是我國地氟病發(fā)病率最高的省份之一[1-2]。研究表明[3]長期處于高氟環(huán)境或攝入過量的氟會(huì)導(dǎo)致機(jī)體許多生理生化改變，氟累積在機(jī)體各組織和器官會(huì)導(dǎo)致不同程度的損害，引發(fā)氟中毒?，F(xiàn)階段，氟中毒損傷的機(jī)制研究主要還存在動(dòng)物水平，成功構(gòu)建氟病區(qū)動(dòng)物模型對氟中毒的研究起到重要作用。氟斑牙、尿氟及骨氟是評判氟中毒動(dòng)物模型構(gòu)建成功的標(biāo)準(zhǔn)[4]。氟中毒損傷是一種慢性過程，成功構(gòu)建氟病區(qū)動(dòng)物模型耗時(shí)過長，其模型構(gòu)建是否受雌雄性別的影響，未見有相關(guān)的研究論證。因此，本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建氟中毒SD大鼠動(dòng)物模型，觀察比較雌雄大鼠體重、氟斑牙出現(xiàn)的時(shí)間、尿氟和骨氟含量，驗(yàn)證氟中毒對雌雄大鼠的差異性影響，從而豐富氟中毒動(dòng)物模型制備的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，提高模型選擇的精準(zhǔn)性，這一比較研究對闡明氟中毒的毒性機(jī)理具有實(shí)用意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供斷乳5周齡，體重150 g左右，清潔級SD大鼠48只 [SCXK (黔) 2012-0001]，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境溫度20℃～25℃，濕度(60±20)%，正常明暗交替 [SYXK (黔) 2012-0001]。

1.2 主要儀器

數(shù)字式離子計(jì)(江蘇江分店精密分析儀器有限公司)；氟離子選擇性電極(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(美國雙杰兄弟有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及氟中毒模型構(gòu)建

大鼠一周適應(yīng)性飼養(yǎng)，無異常發(fā)現(xiàn)后，根據(jù)體重由小到大排序，按隨機(jī)數(shù)表法分組、編號，分為對照組24只、染氟組24只，雌雄各半。

構(gòu)建動(dòng)物模型方法：實(shí)驗(yàn)經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施(1305020)，各組自由飲用自來水，模型組自由食用含氟飼料，飼料含氟量100 mg/kg。每三天動(dòng)態(tài)觀察大鼠日常情況(毛色、飲水、食用飼料量等)，觀察大鼠牙齒的變化并稱重、記錄數(shù)據(jù)。每周調(diào)整鼠籠的位置，力求各組大鼠的實(shí)驗(yàn)條件一致。分別于70 d雌鼠全部出現(xiàn)氟斑牙時(shí)股動(dòng)脈取血處死一批大鼠，110 d雄鼠全部出現(xiàn)氟斑牙時(shí)股動(dòng)脈取血處死一批大鼠。

1.3.2 氟斑牙標(biāo)準(zhǔn)

每兩天觀察各組大鼠牙齒變化情況，判定大鼠牙齒的損傷程度并做好記錄。處死大鼠前對各大鼠的牙齒進(jìn)行拍照。氟斑牙分為正常、輕度、中度、重度四度標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行[5]。正常：牙齒呈淡黃色或棕黃色，牙表面光滑有光澤，呈半透明狀；輕度：牙表面黃白相間，白平色白堊條紋清晰；中度：牙表面呈無光澤粉筆樣白色斑；重度：牙表面出現(xiàn)小溝、裂紋或部分?jǐn)嗔衙撀洌例X呈鋸齒狀嚴(yán)重缺損。

1.3.3 體重測定

每三天使用電子天平對各組大鼠進(jìn)行稱重并記錄。

1.3.4 尿氟和骨氟含量檢測

尿氟在處死大鼠之前用代謝籠收集24 h尿，使用氟離子選擇電極法測定氟含量。骨氟在股動(dòng)脈取血處死大鼠后，取長骨，將附著的組織和脂肪剔除干凈，灰化，采用氟離子選擇電極法檢測骨氟含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠狀態(tài)

至實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組動(dòng)物均無非正常死亡。對照組大鼠食欲正常，精神較好，毛色有光澤；染氟組大鼠食欲降低，其中雄鼠活動(dòng)減少，精神萎靡不振，毛色光澤度下降，雌鼠怕光、怕音、躁動(dòng)，易有攻擊性。

2.2 各組大鼠氟斑牙情況

對照組雌雄大鼠實(shí)驗(yàn)全過程均未出現(xiàn)氟斑牙，牙呈棕色或棕黃色、色澤光滑的半透明狀。染氟組大鼠自由食用含氟飼料，雌鼠首次出現(xiàn)肉眼氟斑牙時(shí)間在自由食用含氟飼料60 d左右，約一周后染氟組雌鼠全部出現(xiàn)氟斑牙，隨染氟時(shí)間的延長，呈棕、白色相間橫紋，直至20 d前后整個(gè)牙面呈白粉筆樣。雄鼠首次出現(xiàn)肉眼氟斑牙時(shí)間在自由食用含氟飼料80 d左右，結(jié)果顯示雄鼠首次出現(xiàn)氟斑牙比雌鼠晚約20 d，約25 d后染氟組雄鼠全部出現(xiàn)氟斑牙，因此將雌鼠(70 d)和雄鼠(110 d)全部出現(xiàn)氟斑牙時(shí)間點(diǎn)作為本次實(shí)驗(yàn)的模型截止時(shí)間。各組大鼠氟斑牙具體結(jié)果見表1和圖1。

2.3 各組大鼠體重變化

染氟前雌雄大鼠體重未見明顯差異，染氟30 d左右雌雄大鼠進(jìn)入快速生長期，且雌雄大鼠體重相比差異有顯著性(P< 0.01)。相同性別大鼠比較，隨染氟時(shí)間延長，110 d染氟組雄鼠體重高于對照組，差異無顯著性(P> 0.05)；110 d染氟組雌鼠體重高于對照組，差異無顯著性(P> 0.05)，結(jié)果顯示大鼠體重與染氟時(shí)間呈正相關(guān)性，見表2。

2.4 各組大鼠尿氟變化

隨染氟時(shí)間延長，雌雄大鼠尿氟逐漸升高，染氟組明顯高于對照組，且差異有顯著性(P< 0.01)，結(jié)果顯示尿氟與染氟時(shí)間呈正相關(guān)。不同性別大鼠尿氟比較，雄鼠尿氟高于雌性，且差異有顯著性(P< 0.01)，尿氟結(jié)果顯示腎臟排泄氟受性別的影響，結(jié)果見表3。

表1 各組大鼠氟斑牙發(fā)生情況

注：A：正常；B：輕度；C：中度；D：重度。圖1 氟中毒大鼠氟斑牙情況Note. A: Normal; B: Mild; C: Moderate; D: Severe.Fig.1 Dental fluorosis of the fluorosis rats

組別Groups雄鼠Malerats雌鼠Femalerats對照組Controlgroup染氟組Fluorosisgroup對照組Controlgroup染氟組Fluorosisgroup染氟前Beforefeedingwithfluorine?containingfeedstuff1524±1131471±1601353±11．51375±8．630d3384±2023407±2462076±15．2??2053±13．1??70d4132±2234016±2332379±10．9??2353±12．5??110d4452±1554685±3312425±7．3??2487±10．6??

注：與雄鼠比較，**P< 0.01。

Note. Compared with the male rats,**P< 0.01.

2.5 各組大鼠骨氟變化

隨染氟時(shí)間延長，雌雄大鼠骨氟逐漸升高，染氟組明顯高于對照組，且差異有顯著性(P< 0.01)，結(jié)果顯示骨氟與染氟時(shí)間呈正相關(guān)。不同性別大鼠骨氟比較，雄鼠骨氟高于雌鼠，且差異有顯著性(P< 0.01)，骨氟結(jié)果顯示骨骼吸收沉積氟含量受性別的影響，結(jié)果見表4。

3 討論

地氟病發(fā)病機(jī)理及病因的研究已取得了一定的成果，但其發(fā)病的分子機(jī)理還未闡明，許多毒性機(jī)理有待實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。因此，通過建立高仿真的氟病區(qū)動(dòng)物模型，解析其損傷的分子機(jī)理，將有助于推進(jìn)地氟病的研究水平，為探索有效防治氟中毒提供途徑和方法。目前研究人員已經(jīng)采用不同的技術(shù)手段成功地復(fù)制了氟中毒模型，但均相對存在無法確定證實(shí)的問題。研究發(fā)現(xiàn)，利用大鼠、小鼠來建立氟中毒動(dòng)物模型，有利于模擬人的受毒環(huán)境[6-7]。但研究還表明不同品系的小鼠對氟的敏感性差異較大，證實(shí)大鼠為氟的易感鼠系，且容易飼養(yǎng)，為最理想氟中毒動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[8]。本實(shí)驗(yàn)研究選用SD大鼠為模型動(dòng)物，進(jìn)一步解析雌雄大鼠對氟毒性的區(qū)別。

地氟病是長期攝入過量氟而發(fā)生的一種慢性全身性疾病，體征表現(xiàn)最主要是氟斑牙和氟骨癥，其早期最常見而突出的癥狀是氟斑牙。氟斑牙是牙齒發(fā)育過程中機(jī)體攝取過量的氟而導(dǎo)致萌出后牙齒表面形態(tài)異常的一種疾病。氟斑牙模型大鼠的特征性改變表現(xiàn)為萌出后牙齒表面黃色、黃褐色等釉質(zhì)礦化不全的改變或釉質(zhì)表面、切牙釉質(zhì)呈棕白相間的條紋[9-10]，進(jìn)而引起牙齒的損傷，可以特異直觀地反映氟對牙組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的毒性損傷程度[11-12]。氟斑牙的判斷是氟中毒模型成功的關(guān)鍵，同時(shí)也是唯一可以用肉眼觀察到的慢性氟中毒的早期臨床體征，是衡量氟中毒情況的良好指標(biāo)，且染毒劑量越大，形成的時(shí)間越短。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組雌雄大鼠實(shí)驗(yàn)全程牙外觀呈棕色或棕黃色、色澤光滑的半透明狀。染氟組大鼠自由食用含氟飼料，雌鼠首次出現(xiàn)肉眼氟斑牙時(shí)間在自由食用含氟飼料60 d左右，約一周時(shí)間染氟組雌鼠全部出現(xiàn)氟斑牙。這與白生賓等研究報(bào)道雌性大鼠60 d左右出現(xiàn)氟斑牙基本相吻合[13]。隨著染氟時(shí)間延長，氟離子在牙齒中一直處于沉積狀態(tài)，氟離子蓄積濃度升高，牙呈棕、白色相間橫紋，直至20 d左右整個(gè)牙面呈白粉筆樣。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雄鼠首次出現(xiàn)肉眼氟斑牙時(shí)間在自由食用含氟飼料80 d左右，約25 d后染氟組雄鼠全部出現(xiàn)氟斑牙。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次發(fā)現(xiàn)雄鼠出現(xiàn)氟斑牙時(shí)間比雌鼠晚約20 d，顯示氟在雌雄個(gè)體間引起氟斑牙發(fā)生情況存在明顯的性別差異性。這是否提示我們在不考慮性別差異情況下，選擇復(fù)制雌性大鼠動(dòng)物模型可節(jié)省時(shí)間、物力及人力，結(jié)果將為今后氟中毒研究選擇動(dòng)物提供重要意義。

復(fù)制氟中毒模型判斷主要從動(dòng)物的一般狀況、體重變化、牙齒形態(tài)及長度、機(jī)體氟的水平和組織病理學(xué)檢測等方面進(jìn)行。監(jiān)測體重變化可較好體現(xiàn)動(dòng)物體格生長發(fā)育狀況及衡量機(jī)體營養(yǎng)情況，是實(shí)時(shí)反映外界毒物影響的最直接指標(biāo)。曾貝貝等研究報(bào)道，不同劑量氟化物可影響雄鼠和雌鼠體重變化[14]。截止本實(shí)驗(yàn)結(jié)束，各組大鼠均無非正常死亡。本實(shí)驗(yàn)每三天稱量大鼠體重并記錄，結(jié)果顯示，對照組大鼠食欲正常，精神較好，毛色有光澤；染氟組大鼠食欲降低，其中雄鼠活動(dòng)減少，精神萎靡不振，毛色光澤度下降；雌鼠怕光怕音，易躁動(dòng)有攻擊性。染氟前雌雄大鼠體重未見明顯差異，染氟30 d左右雌雄大鼠進(jìn)入快速生長期，且雌雄大鼠體重間有明顯的差異性，這與實(shí)驗(yàn)證實(shí)約75 d以后，大鼠進(jìn)入快速生長期，雌雄體重開始存在明顯差異相吻合[15-16]。隨染氟時(shí)間延長，110 d染氟組雄鼠體重高于對照組，差異無顯著性(P> 0.05)；染氟組雌鼠體重高于對照組，差異無顯著性(P> 0.05)，結(jié)果顯示大鼠體重與染氟時(shí)間呈正相關(guān)性。

表3 各組大鼠尿氟變化情況

注：與對照組比較，**P< 0.01；與雄鼠比較，△△P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01. Compared with the male rats,△△P< 0.01.

表4 各組大鼠骨氟變化情況

注：與對照組比較，**P< 0.01，與雄鼠比較，△△P< 0.01。

Note. Compared with the control group,**P< 0.01. Compared with the male rats,△△P< 0.01.

研究發(fā)現(xiàn)機(jī)體吸收的氟約有50%可通過尿液、汗腺、消化道等途徑排出，其中由腎泌尿排泄的氟約占總排氟量的85%左右[17]。因此，尿氟可作為機(jī)體氟暴露的最好指標(biāo)，在一定程度上可反映體內(nèi)氟蓄積的情況，是判斷復(fù)制氟中毒動(dòng)物模型成功的重要依據(jù)[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨染氟時(shí)間延長，尿氟逐漸升高，染氟組明顯高于對照組，且差異有顯著性(P< 0.01)，提示尿氟與染氟時(shí)間呈正相關(guān)。不同性別大鼠尿氟比較，雄鼠尿氟高于雌性，且差異有顯著性(P< 0.01)，提示腎臟排泄氟受性別的影響。

機(jī)體吸收氟主要通過消化道途徑，吸收氟90%以上分布在骨組織，氟對骨骼有特殊親和力[19]。骨骼是構(gòu)成機(jī)體的重要器官，同時(shí)也是氟作用的靶器官。如果機(jī)體長期過量攝入氟化物，氟在骨骼大量蓄積會(huì)影響骨的正常代謝，導(dǎo)致骨組織形態(tài)、結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，即可發(fā)生氟骨癥[20-21]。因此測定骨組織的氟含量是判斷氟中毒動(dòng)物模型的重要指標(biāo)[22]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨染氟時(shí)間延長，雌雄大鼠骨氟逐漸升高，染氟組明顯高于對照組，且差異有顯著性(P< 0.01)，結(jié)果提示骨氟與染氟時(shí)間呈正相關(guān)。不同性別大鼠骨氟比較，雄鼠骨氟高于雌鼠，且差異有顯著性(P< 0.01)，提示骨骼吸收沉積氟含量受性別的影響。

綜上所述，判斷氟中毒動(dòng)物模型復(fù)制成功依據(jù)主要從氟斑牙、尿氟及骨氟等方面來觀察[23-24]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，機(jī)體攝入過量氟可影響雌雄大鼠生活狀況及體重，發(fā)現(xiàn)雄鼠出現(xiàn)氟斑牙晚于雌鼠，且雄鼠通過尿排泄氟多于雌鼠，骨骼沉積氟高于雌鼠，提示雌雄性別不同對氟毒性存在差異，該結(jié)果對今后我們有選擇性復(fù)制動(dòng)物模型起到重要作用。

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