李一帆，楊 娜，王 瑤，尹德琦，趙 旭，桑曉宇*，漢麗梅*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，沈陽 110866； 2.遼寧省人獸共患病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽 110866)

唾液酸(sialic acid)是通過N末端或O末端連接在糖蛋白或糖脂末端單糖家族的總稱。唾液酸的核心結(jié)構(gòu)包含9個(gè)碳原子，并且通常在第4、5、7、8和9號位的碳原子發(fā)生修飾可形成不同的唾液酸衍生物[1]。根據(jù)5號位的碳原子連接的基團(tuán)不同，可以將唾液酸初步分為N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid，Neu5Ac)、N-羥乙酰神經(jīng)氨酸(N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc)和脫氨神經(jīng)氨酸(deaminoneuraminic acid，KDN)[2]。在哺乳動物細(xì)胞中唾液酸的主要存在形式包括Neu5Ac和Neu5Gc，并且在胞苷單磷酸-N-乙酰神經(jīng)氨酸羥化酶(cytidine monophospho-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH)的作用下CMP-Neu5Ac可生成Neu5Gc[3]。研究者已經(jīng)在豬氣管上皮細(xì)胞[4]、鴨結(jié)腸的隱窩上皮細(xì)胞、馬氣管上皮細(xì)胞和鴿子的結(jié)腸與氣管中檢測到Neu5Gc。不僅如此，研究者應(yīng)用高效液相色譜(HPLC)在雞的氣管和腸道表面也檢測到Neu5Gc[5]。由于人體內(nèi)的CMAH基因丟失了92 bp，導(dǎo)致人失去了合成Neu5Gc的能力[4]。最近研究表明，與人類的情況類似，雪貂也不能合成Neu5Gc[6]。

研究表明多種病原微生物都能利用在哺乳動物細(xì)胞表面廣泛存在的唾液酸作為受體，包括細(xì)菌、寄生蟲和病毒等[7]，與之結(jié)合并入侵宿主細(xì)胞，但不同的病原選擇不同的唾液酸衍生物作為受體[8]。A型和B型流感病毒主要識別宿主細(xì)胞表面以2, 3糖苷鍵或2, 6糖苷鍵連接的Neu5Ac，而馬流感病毒主要結(jié)合受體是Neu5Gc[9]。研究表明在A549細(xì)胞表面外源表達(dá)的Neu5Gc受體能夠抑制A型流感病毒的感染[10]。不僅如此，有研究表明人體紅細(xì)胞表面缺少Neu5Gc受體的表達(dá)，能夠限制諾氏瘧原蟲的跨種傳播[11]。相反，多瘤病毒、輪狀病毒等同時(shí)能夠識別Neu5Ac和Neu5Gc并作為入侵宿主的受體[12]。由此可見，宿主細(xì)胞表面唾液酸受體的類型與病原的入侵密切相關(guān)。

不同物種或同一物種的不同組織中細(xì)胞表面多聚糖末端結(jié)合的Neu5Gc和Neu5Ac所占比例都不同。在小鼠和大鼠組織中Neu5Gc和CMP-Neu5Ac的表達(dá)比例主要依靠CMAH的活性水平[13]。盡管腦組織中的唾液酸含量非常高[14]，但在大多數(shù)哺乳動物腦組織內(nèi)很少能夠檢測到Neu5Gc。在神經(jīng)組織中起到非常重要作用的神經(jīng)節(jié)苷脂和神經(jīng)細(xì)胞粘附分子(neural cell adhesion molecule，NCAM)中的多聚唾液酸僅包含Neu5Ac。本研究通過應(yīng)用相對熒光定量PCR的方法檢測Neu5Cc合成途徑中關(guān)鍵酶(CMAH)的基因在不同小鼠組織中轉(zhuǎn)錄水平，為進(jìn)一步分析不同組織中所含Neu5Gc含量差異提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

采用遼寧省實(shí)驗(yàn)動物資源中心培育的5只SPF級雌性BALB/c小鼠，體重18～20 g [SCXK (遼) 2015-0001]，[SYXK (遼) 2015-0001]，質(zhì)量檢測單位：中國食品藥品檢定研究院。

1.2 主要試劑與儀器

BIOZOL Total RNA Extraction Reagent(TRIzol)購于Bio Flux公司；PrimeScriotTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(反轉(zhuǎn)錄試劑盒)與SYBR? Premix Ex TaqTMII(熒光定量PCR試劑盒)均購于Takara公司；2× RNA Loading Buffer購于Solarbio公司；DEPC購于Amresco公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器：Thermo Fisher公司QuantStudio? 6 Flex；電泳儀：北京六一生物技術(shù)有限公司DYY-7C型；凝膠成像儀：UVP公司GelDoc-It2 Imager型；低溫離心機(jī)：德國Eppendorf公司Centrifuge 5427R型。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)樣本的采集

組織樣品采集于5只健康的SPF級BALB/c鼠。實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動物使用的3R原則給予人道主義關(guān)懷。各樣品均采集于不同臟器的相同部位。為保證提取RNA的質(zhì)量，用乙醚致暈小鼠后對其斷頸處死，立即采集其肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟、小腸、骨骼肌、氣管及腦組織，并用預(yù)冷的生理鹽水漂洗血液，后迅速剪成小塊(約0.1 g)，浸入液氮速凍后，立刻投入裝有TRIzol的2 mL去酶離心管，于-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

表1 CMAH與β-actin基因熒光定量PCR引物

1.3.2 RNA的提取、檢驗(yàn)與反轉(zhuǎn)錄

采用TRIzol法提取各組織中的RNA；采用Nano Drop 2000c檢測其濃度，通過OD260/OD280與OD260/OD230的比值初步判斷RNA是否有降解和污染；并運(yùn)用RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠(1%)電泳對其完整性進(jìn)行檢驗(yàn)，電泳條件為：預(yù)電泳80 V(15 min)，正式電泳50 V(50 min)。采用PrimeScriotTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：首先42℃，2 min去除基因組DNA；再選擇隨機(jī)引物經(jīng)37℃，15 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；最后經(jīng)85℃，5 s終止反應(yīng)。

1.3.3 熒光定量PCR方法

(1)引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中登錄的小鼠CMAH基因序列(NM_001111110)和β-actin基因序列(NM_007393)，應(yīng)用ABI Primer Express 3.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物，其中以β-actin作為內(nèi)參基因。對所設(shè)計(jì)引物的特異性和擴(kuò)增效率等因素進(jìn)行分析，選擇引物序列如表1所示。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

(2)制作相對熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求與條件選用SYBR Green，2-ΔCt相對定量法進(jìn)行熒光定量PCR檢測。將原始cDNA模板作3倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，分別制作2對引物標(biāo)準(zhǔn)曲線，探索退火溫度使各對引物的擴(kuò)增效率在其它各項(xiàng)指標(biāo)的允許范圍內(nèi)接近100%，最終確定反應(yīng)體系為SYBR Premix Ex Taq II(2×)10 μL，ROX Reference Dye II(50×)0.4 μL，PCR forward primer(10 μmol/L)0.8 μL，PCR reverse primer(10 μmol/L)0.8 μL，template 2 μL，ddH2O 6 μL；最佳反應(yīng)條件為：預(yù)變性95℃，30 s；PCR反應(yīng)95℃，5 s，60℃，30 s，72℃，30 s，共40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)采集熒光信號；之后進(jìn)行溶解曲線分析，95℃，15 s，60℃，60 s，95℃，15 s。

(3)qPCR相對定量檢測：陰性對照以水為模板，20 μL反應(yīng)體系，分別做5個(gè)生物學(xué)重復(fù)及3個(gè)組內(nèi)重復(fù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所得qPCR相對定量數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行One-way ANOVA分析，以P< 0.05為差異有顯著性，應(yīng)用GraphPad Prism 5軟件制圖。

2 結(jié)果

2.1 RNA的質(zhì)量與完整性檢測結(jié)果

檢測所提取各組織總RNA的OD260/OD280比值均介于1.90～2.10之間，OD260/OD230的比值均介于1.90～2.20之間，且稍大于OD260/OD280的比值，其濃度也滿足反轉(zhuǎn)錄需要。將BALB/c小鼠各組織總RNA進(jìn)行甲醛變性瓊脂糖凝膠，完整性檢測如圖1所示，各樣品中的28s、18s、5s三條特異性條帶均清晰可見，且28s亮度約為18s的2倍，說明所提取的總RNA完整性較好，無明顯降解，滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)需求。

注：1：心?。?：肝臟；3：氣管；4：小腸；5：腎臟；6：腦組織；7：骨骼??；8：肺臟；9：脾臟。圖1 總RNA完整性檢驗(yàn)Note. 1: Myocardium; 2: Liver; 3: Trachea; 4: Small intestine; 5: Kidney; 6: Brain; 7: Skeletal muscle;8: Lung; 9: Spleen.Fig.1 Integrity of the total RNA

2.2 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

本實(shí)驗(yàn)選擇SYBR Green染料法，以3倍梯度稀釋肝臟組織的原始cDNA，不少于5個(gè)稀釋點(diǎn)，以水為模板作陰性對照，均重復(fù)三個(gè)加樣孔，分別制作CMAH與β-actin兩對引物的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增曲線如圖2A、2B所示，模板3倍梯度稀釋擴(kuò)增曲線重復(fù)性好，間距一直。溶解曲線如圖2C、2D所示，各引物均為特異性的單峰，無非特異性擴(kuò)增，說明各對引物特異性良好，并且無引物二聚體等結(jié)構(gòu)。兩基因相對標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2E、2F所示，β-actin與CMAH引物的擴(kuò)增效率分別為101.728%、104.210%，接近100%，組內(nèi)差距小，重復(fù)性好。

注：A：β-actin基因的擴(kuò)增曲線；B：CMAH基因的擴(kuò)增曲線；C：β-actin基因的溶解曲線；D：CMAH基因的溶解曲線；E：β-actin基因的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線；F：CMAH基因的相對標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2 相對標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立Note. A: Amplification curve of β-actin. B: Amplification curve of CMAH. C: Dissolution curve of β-actin. D: Dissolution curve of CMAH. E: Standard curve of β-actin. F: Standard curve of CMAH.Fig.2 Establishment of the relative standard curves

以上數(shù)據(jù)證明本試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)所選2對熒光定量PCR引物及其相應(yīng)反應(yīng)條件可滿足SYBR Green、2-ΔCt相對定量法進(jìn)行熒光定量PCR檢測的條件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果真實(shí)可信。

2.3 qPCR相對定量檢測結(jié)果

根據(jù)上文中所建立的相對熒光定量PCR的實(shí)驗(yàn)條件，分別對小鼠的肝臟、脾臟、腎臟、氣管、肺臟、心肌、骨骼肌、小腸和腦組織的CMAH與β-actin基因進(jìn)行熒光定量PCR檢測，檢測結(jié)果如表2所示，并選擇2-ΔCt進(jìn)行差異表達(dá)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：CMAH基因在BALB/c小鼠肝臟內(nèi)表達(dá)最為豐富，后依此為脾臟、腎臟、氣管、肺臟、心肌、骨骼肌和小腸，而腦組織中表達(dá)量極低。其中肝臟組織CMAH基因表達(dá)量分別達(dá)到脾臟的2.46倍；腎臟的3.17倍；氣管的5.14倍；肺臟的11.70倍；心肌的21.12倍；骨骼肌的31.37倍；小腸的66.90倍；腦組織的1055.99倍。

表2 BALB/c 小鼠各組織臟器CMAH/β-actin基因熒光定量PCR檢測結(jié)果

注：1：肝臟；2：脾臟；3：腎臟；4：氣管；5：肺臟；6：心??；7：骨骼??；8：小腸；9：腦。以內(nèi)參(β-actin)的轉(zhuǎn)錄水平為1并對其他轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行校正。與肝臟比較，** P< 0.01。圖3 CMAH基因在不同組織中的轉(zhuǎn)錄水平Note. 1: Liver; 2: Spleen; 3: Kidney; 4: Trachea; 5: Lung; 6: Myocardium; 7: Skeletal muscle; 8. Small intestine; 9: Brain. Transcriptional levels of CMAH were normalized to those of the internal control (β-actin). Compared with the liver,** P < 0.01.Fig.3 Transcriptional levels of CMAH in different tissues

3 討論

細(xì)胞表面的唾液酸可參與細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-病原體之間的信息交換[15]、免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)及大量粘附過程。當(dāng)前研究表明，細(xì)胞表面兩種重要唾液酸衍生物就是Neu5Ac和Neu5Gc。CMAH可催化Neu5Ac發(fā)生羥基化合成Neu5Gc，此過程具有高度特異性。在不同種動物相同組織內(nèi)及在同種動物不同組織內(nèi)，Neu5Ac與Neu5Gc所占比例均有差異[16]。由于CMAH基因堿基缺失、CMAH蛋白表達(dá)障礙或失活等原因，包括人在內(nèi)的一些動物(雪貂、海豹、部分爬行動物和鳥類等)都不能合成Neu5Gc[17]，但在其他哺乳動物中CMAH基因卻可以高效表達(dá)并且Neu5Gc含量豐富[18]，但是又有明顯的組織差異性。已有研究表明，小鼠血清中含有Neu5Gc，說明小鼠CMAH基因能夠表達(dá)具有生物學(xué)功能的羥化酶，但對不同組織中CMAH基因轉(zhuǎn)錄水平的研究較少[7]。本研究中，通過相對定量PCR方法能夠在正常BLAB/c小鼠的9種組織中檢測到CMAH基因的轉(zhuǎn)錄，但其轉(zhuǎn)錄情況差異較大，肝臟中的轉(zhuǎn)錄水平最高，其次依次為脾臟、腎臟、氣管，而肺臟、心肌、骨骼肌、小腸和腦組織中的轉(zhuǎn)錄水平都比較低，此結(jié)果與先前發(fā)表文章的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致[18]。當(dāng)前，我們尚未完全闡明不同物種或者同一個(gè)體間不同組織的Neu5Gc表達(dá)差異的調(diào)控機(jī)制，但宿主細(xì)胞表面的唾液酸組成類型確實(shí)能夠影響不同病原與宿主之間的相互作用，值得我們進(jìn)一步探索。

熒光定量PCR方法自建立以來已經(jīng)廣泛應(yīng)用檢測基因表達(dá)調(diào)控的初步探索，根據(jù)中心法則，我們知道基因轉(zhuǎn)錄情況的分析不能完全反映出蛋白表達(dá)情況，但是與Western blot等免疫學(xué)方法相比較，熒光定量PCR方法可以快速檢測出目的基因轉(zhuǎn)錄情況，以此來初步評估蛋白的表達(dá)水平。因此，本研究成功建立BALB/c小鼠CMAH基因相對熒光定量PCR檢測方法，并確定其在多種組織中均有轉(zhuǎn)錄但差異較大，此結(jié)果為進(jìn)一步分析BALB/c小鼠不同組織中所含Neu5Gc差異提供參考依據(jù)。

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