劉撿娣，謝 龍，肖 坤，朱金海，謝東明*

(1.贛南醫(yī)學(xué)院2015級(jí)碩士研究生，江西 贛州 341000； 2.贛南醫(yī)學(xué)院2016級(jí)碩士研究生，江西 贛州 341000； 3.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，江西 贛州 341000)

心肌肥厚(myocardial hypertrophy，MH)是心肌組織壓力超負(fù)荷的一種代償性反應(yīng)，以心肌細(xì)胞蛋白質(zhì)合成增加、心肌細(xì)胞體積增大及間質(zhì)成分改變?yōu)橹饕卣?，是引起多種心血管疾病發(fā)病率和病死率升高的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[1-2]。近年來(lái)有研究表明，心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與氧化應(yīng)激有著密切的聯(lián)系[3-4]，其中氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)對(duì)心肌肥厚的氧化作用的致病機(jī)制較受認(rèn)可。ROS介導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路激活，通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB進(jìn)入核內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)，參與心肌肥厚的病理過(guò)程[5]。氮氧自由基(nitroxide radicals，NRs)是含有C、N、O和自旋單電子的有機(jī)化合物，早期被用作闡明細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的自旋示蹤劑[6]。NRs可以通過(guò)清除體內(nèi)的ROS來(lái)減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)所致的損傷，改善心肌肥大癥狀[7-8]。氮氧自由基化合物2, 2, 6, 6-四甲基-4-哌啶醇(tempol)為傳統(tǒng)的氧自由基清除劑，可清除過(guò)多ROS[9]。NRs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景，但目前實(shí)驗(yàn)室與臨床上對(duì)NRs對(duì)抗氧化作用的研究甚少，而對(duì)肥厚型心肌病NF-κB信號(hào)通路的影響研究尚無(wú)。本研究采用異丙腎上腺素(isoprenaline，ISO)建立大鼠心肌肥厚模型，旨在研究氮氧自由基tempol對(duì)心肌肥厚、相關(guān)炎癥因子及NF-κB信號(hào)通路的作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD雄性大鼠，180～220 g，購(gòu)自贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 [SCXK (贛) 2014-0001]，飼養(yǎng)于贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，大鼠的組織取材于贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)施內(nèi)進(jìn)行 [SYXK (贛) 2014-0001]。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑：2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇(tempol)(貨號(hào)：176141-5G)、異丙腎上腺素(貨號(hào)：I5627-5G)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，蘇木素伊紅染色液(貨號(hào)：DH0006-100)、TRIzol(貨號(hào)：NR0002)購(gòu)于北京雷根生物技術(shù)有限公司，cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào)：KR106)、SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版試劑盒(貨號(hào)：FP205)購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，RIPA裂解液I、BCA蛋白定量測(cè)定試劑盒、p65一抗(貨號(hào)：10745-1-AP)、IκBα一抗(貨號(hào)：10268-1-AP)購(gòu)于Proteintech公司，p-p65一抗(貨號(hào)：D155097)、β-actin一抗(貨號(hào)：D110001)購(gòu)于上海生工生物股份有限公司，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG (H + L)(貨號(hào)：ZB-2301)購(gòu)于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，ECL Plus超敏發(fā)光液(貨號(hào)：PE0010)購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

主要儀器：小型高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；冷凍冷藏兩用冰箱(Siemens，德國(guó))；-80℃超低溫冰箱(Thermo Fisher，美國(guó))；MK3型酶標(biāo)儀(Thermo Fisher，美國(guó))；Bio-Rad ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國(guó))；ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI，美國(guó))；轉(zhuǎn)膜儀(百晶生物，北京)；電泳儀(百晶生物，北京)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模

將42只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，每組14只，分別為正常對(duì)照組，心肌肥厚模型組，tempol干預(yù)組。各組(除正常組)大鼠腹腔注射異丙腎上腺素5 mg/kg，每日2次，連續(xù)2周；正常組大鼠腹腔注射等劑量生理鹽水，自由進(jìn)食、給水。于造模完成24 h后，tempol干預(yù)組開(kāi)始給予腹腔注射tempol 100 mg/(kg·d)；心肌肥厚模型組與正常對(duì)照組予以腹腔注射等劑量生理鹽水，連續(xù)8周。本試驗(yàn)由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)為：IACUC-2014-018。

1.3.2 各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)

(1)心臟重量指數(shù)的測(cè)定：大鼠末次給藥后禁食12 h，稱重(body weight，BW)，采用腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉，腹主動(dòng)脈取血完畢后，取心臟，剪去心臟周圍的組織和血管，生理鹽水清洗殘血，濾紙吸干后稱量全心重(heart weight，HW)，沿冠狀溝將左、右心房剪下，沿室間溝將右心室游離去除稱量左心室重量(left ventricular weight(LVW)，計(jì)算全心重量指數(shù)(heart weight index，HWI)：HWI=HW/BW和左心室重量指數(shù)(left ventricular weight index，LVWI)：LVWI=LVW/BW。

(2)心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)及纖維化程度檢測(cè)：取大鼠左心室心肌組織置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋后用切片機(jī)按4 μm厚度切片，按HE染色試劑盒說(shuō)明書(shū)行HE染色，按Masson染色試劑盒說(shuō)明書(shū)行Masson染色，200倍光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織形態(tài)并拍照。

(3)qRT-PCR檢測(cè)心肌組織中TNF-α、IL-6 mRNA的表達(dá)：按照TRIzol產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)流程，提取各組樣本2 μg RNA后，測(cè)RNA濃度及純度。設(shè)計(jì)目的基因上下游引物(表1)，根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，首先合成單鏈cDNA(20 μL體系)，按照SuperReal熒光定量預(yù)混試劑增強(qiáng)版試劑盒說(shuō)明，向?qū)?yīng)反應(yīng)孔加入2× SuperReal PreMix Plus (with SYBR Green I) 10 μL、正向引物(10 μmol/L)0.6 μL、反向引物(10 μmol/L)0.6 μL、cDNA模板2 μL、50× ROX Reference Dye 0.4 μL，加RNase-free ddH2O至20 μL。反應(yīng)條件：第一步預(yù)變性：95℃，15 min，1個(gè)循環(huán)；第二步PCR反應(yīng)：95℃變性10 s，60℃退火/延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)。TNF-α、IL-6、β-actin引物由上海生工生物股份有限公司設(shè)計(jì)(參見(jiàn)表1)。每次擴(kuò)增設(shè)置β-actin基因?yàn)閮?nèi)參照，用ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件進(jìn)行結(jié)果分析。

(4)Western blot檢測(cè)心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達(dá)水平：冰上剪碎心肌組織，按說(shuō)明加入RIPA裂解液I(每100 g組織加入RIPA液1 mL、蛋白酶抑制劑1 μL、磷酸酶抑制劑5 μL)并勻漿，4℃放置10 min，期間劇烈震蕩3～4次，12 000 r/min，4℃離心5 min，取上清。BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，并分裝50 μg心肌組織蛋白樣本。行10% SDS-PAGE分離膠電泳，之后濕法轉(zhuǎn)到PVDF膜上(Millipore，美國(guó))。Western blot BSA封閉液體(1× PBS)于水平搖床室溫封閉1 h，分別孵以IκBα一抗(1∶2500稀釋)、p-p65一抗(1∶1000稀釋)、p65一抗(1∶2500稀釋)、β-actin一抗(1∶2500稀釋)，4℃搖床過(guò)夜。次晨1× TBST洗膜10 min，重復(fù)3次后加入二抗(1∶20 000稀釋)，37℃孵育1 h。1× TBST洗膜10 min，重復(fù)3次，ECL顯影，保存圖像，用Image Lab 5.1軟件計(jì)算蛋白條帶面積，結(jié)果以目的蛋白/內(nèi)參吸光度的比值表示。β-actin作為內(nèi)參使用。各組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 qRT-PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 心臟重量指數(shù)結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，模型組的HWI、LVWI增加(P< 0.05)；與模型組比較，tempol組HWI、LVWI減小(P< 0.05)。結(jié)果參見(jiàn)表2。

2.2 心肌組織HE染色結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠心肌組織肌纖維增粗、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細(xì)胞橫截面積增大，胞核深染；與模型組比較，tempol組心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細(xì)胞肥大程度降低。見(jiàn)圖1。

2.3 心肌組織Masson染色結(jié)果

鏡下觀察結(jié)果顯示，正常對(duì)照組多為紅色為主的心肌纖維及藍(lán)色的細(xì)胞核，心肌間質(zhì)僅見(jiàn)少許淡藍(lán)色的膠原纖維；與正常對(duì)照組相比，心肌肥厚模型組大鼠心肌纖維化加重，心肌間質(zhì)膠原纖維增加；與模型組相比，tempol組心肌纖維化程度改善，間質(zhì)膠原纖維減少。見(jiàn)圖2。

表2 各實(shí)驗(yàn)組心臟重量指數(shù)結(jié)果

注：與正常對(duì)照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

2.4 心肌組織TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

與正常對(duì)照組比較，模型組TNF-α、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯增加(P< 0.05)；與模型組比較，tempol組TNF-α、IL-6 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平降低，差異有顯著性(P< 0.05)。結(jié)果參見(jiàn)表3。

注：A：正常對(duì)照組；B：Tempol組；C：模型組。圖1 各實(shí)驗(yàn)組心肌組織HE染色結(jié)果(× 200)Note. A: Normal control group; B: Tempol group; C: Model group.Fig.1 Myocardial tissues of the rats in each group. HE staining

注：A：正常對(duì)照組；B：Tempol組；C：模型組。圖2 各實(shí)驗(yàn)組心肌組織Masson染色結(jié)果(× 200)Note. A: Normal control group; B: Tempol group; C: Model group.Fig.2 Myocardial tissues of the rats in each group. Masson staining

2.5 心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達(dá)水平

與正常對(duì)照組比較，模型組p-p65/p65的表達(dá)明顯增加，NF-κB抑制蛋白IκBα表達(dá)降低(P< 0.05)；與模型組比較，tempol組IκBα表達(dá)增加，p-p65/p65的表達(dá)有不同程度降低(P< 0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討論

心肌肥厚(myocardial hypertrophy，MH)是心肌組織壓力超負(fù)荷的一種代償性反應(yīng)，心肌肥厚發(fā)生過(guò)程伴隨心肌重構(gòu)，其主要病理變化包括心肌細(xì)胞肥大、心肌間質(zhì)增殖以及心肌細(xì)胞外基質(zhì)重建等；而長(zhǎng)期的心肌病理性肥厚可引起心臟舒張和收縮功能不全，最終導(dǎo)致心肌缺血、心律失常、心衰和猝死等[11-13]。心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制與多種因素相關(guān)，心肌細(xì)胞對(duì)多種刺激因素所產(chǎn)生的適應(yīng)性反應(yīng)，其病理過(guò)程復(fù)雜。因此如何有效的防治心肌細(xì)胞肥厚、心臟病理性重構(gòu)是心血管科學(xué)研究的重要課題，深入探索心肌病理性重構(gòu)的發(fā)生機(jī)制及尋找有效的治療靶點(diǎn)對(duì)防治心肌肥厚意義重大。

研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB信號(hào)通路在心肌細(xì)胞的病理變化及心室重構(gòu)中作用很大[14-17]。NF-κB是廣泛存在于細(xì)胞內(nèi)的一種具有多向性調(diào)節(jié)作用的轉(zhuǎn)錄因子，最常見(jiàn)的NF-κB二聚體是p65與p50組成的異二聚體。在靜息狀態(tài)下，NF-κB的抑制蛋白IκB蛋白家族之一IκBα與NF-κB的p65、p50兩個(gè)亞單位以失活狀態(tài)存在于細(xì)胞質(zhì)中。促炎性或促氧化物直接刺激機(jī)體產(chǎn)生活性氧(reactive oxygen species，ROS)，改變細(xì)胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)，IκB激酶(IκB kinase，IKK)被激活，從而導(dǎo)致IκB蛋白磷酸化、泛素化，隨后被蛋白酶體降解，NF-κB二聚體得到釋放并迅速移位到細(xì)胞核誘導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致組織損傷，參與多種心血管疾病的病理過(guò)程[14, 18]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)一些氮氧自由基(nitroxide radicals，NRs)等抗氧化劑可以通過(guò)清除過(guò)量產(chǎn)生的ROS，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化，維持機(jī)體抗氧化酶系正?；钚裕瑥亩鴾p輕氧化應(yīng)激對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的病理?yè)p害，有效地預(yù)防和逆轉(zhuǎn)肥厚反應(yīng)，為臨床防治心肌肥厚開(kāi)辟新的思路和方法[19-20]。NRs具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

表3 各實(shí)驗(yàn)組心肌組織TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平

注：與正常對(duì)照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。

Note. Compared with the normal control group,*P< 0.05. Compared with the model group,#P< 0.05.

注：A：各組p-p65、p65蛋白Western blot結(jié)果；B：各組IκBα蛋白Western blot結(jié)果；C：p65、p-p65、p-p65/p65蛋白半定量統(tǒng)計(jì)圖，n=9；D：IκBα蛋白半定量統(tǒng)計(jì)圖，n=9。1：對(duì)照組；2：Tempol組；3：模型組。與對(duì)照組相比，*P< 0.05；與模型組相比，#P< 0.05。圖3 心肌組織IκBα、p-p65、p65蛋白的表達(dá)水平Note. A: Western blot of p-p65 and p65 in each group. B: Western blot of IκBα in each group. C: Semi-quantitative histogram of p65, p-p65 and p-p65/65, n=9. D: Semi-quantitative histogram of IκBα, n=9. 1: Control group; 2: Tempol group; 3: Model group. Compared with the control group,*P< 0.05. Compared with the model group,# P< 0.05.Fig.3 Western blot analysis of IκBα, p-p65 and p65 expression in the myocardial tissues of each group

本項(xiàng)目通過(guò)皮下注射異丙腎上腺素ISO的方法建立大鼠心肌肥厚模型，然后給予氮氧自由基tempol干預(yù)，研究氮氧自由基tempol干預(yù)后ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠NF-κB信號(hào)通路及相關(guān)炎癥因子的變化，并探討其對(duì)心肌肥厚的保護(hù)作用。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，心肌肥厚模型組的HWI、LVWI增加，心肌HE染色見(jiàn)肌纖維增粗、心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細(xì)胞表面積增大，間質(zhì)見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，說(shuō)明ISO成功誘導(dǎo)了大鼠心肌肥厚模型；與正常對(duì)照組比較，心肌肥厚模型組的TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平、p-p65/p65水平明顯增加，NF-κB抑制蛋白IκBα表達(dá)減少(P< 0.05)，說(shuō)明經(jīng)ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚模型激活了NF-κB信號(hào)通路。與模型組比較，tempol干預(yù)組HWI、LVWI減小(P< 0.05)，TNF-α、IL-6 mRNA轉(zhuǎn)錄水平、p-p65/p65的表達(dá)有不同程度降低，NF-κB抑制蛋白IκBα表達(dá)增加，降解減少(P< 0.05)，HE染色見(jiàn)心肌結(jié)構(gòu)紊亂、心肌細(xì)胞肥大程度降低，說(shuō)明tempol對(duì)ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚有治療作用，且對(duì)NF-κB信號(hào)通路有抑制作用。因此我們推測(cè)，tempol對(duì)心肌肥厚的干預(yù)作用可能與抑制NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。

在今后的研究中，進(jìn)一步研究tempol、心肌肥厚、NF-κB信號(hào)通路三者的相關(guān)關(guān)系，為肥厚性心肌病的防治提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，對(duì)尋找病理性心肌肥厚相關(guān)治療靶點(diǎn)具有重要意義。

[1] 吳小龍, 薛明明, 司明明, 等. 心肌肥厚發(fā)生機(jī)制及藥物治療的研究進(jìn)展 [J]. 醫(yī)學(xué)綜述, 2015, 21(5): 803-806.

[2] Heinzel FR, Hohendanner F, Jin G, et al. Myocardial hypertrophy and its role in heart failure with preserved ejection fraction [J]. J Appl Physiol (1985), 2015, 119(10): 1233-1242.

[3] 宋艷瑞, 劉忠, 顧淑蓮, 等. 肥厚型心肌病的致病分子機(jī)制研究進(jìn)展 [J]. 遺傳, 2011, 33(6): 549-557.

[4] Haynes P, Campbell KS. Myocardial hypertrophy reduces transmural variation in mitochondrial function [J]. Front Physiol, 2014, 5:178.

[5] 劉麗娜, 李法琦. 心肌肥厚相關(guān)信號(hào)通路的研究進(jìn)展 [J]. 重慶醫(yī)學(xué), 2010, 39(20): 2805-2808.

[6] Hou J, Kang YJ. Regression of pathological cardiac hypertrophy: signaling pathways and therapeutic targets [J]. Pharmacol Ther, 2012, 135(3): 337-354.

[8] Christia P, Bujak M, Gonzalez-Quesada C, et al. Systematic characterization of myocardial inflammation, repair, and remodeling in a mouse model of reperfused myocardial infarction [J]. J Histochem Cytochem, 2013, 61(8): 555-570.

[9] 景臨林, 馬慧萍, 樊鵬程, 等. 氮氧自由基對(duì)模擬高原缺氧小鼠心肌組織缺氧和凋亡蛋白的影響 [J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2016, 51(6): 459-462.

[10] 趙祎鐳, 李丹露. 心肌肥厚模型建立方法的研究進(jìn)展 [J]. 中國(guó)藥房, 2014, 25(5): 473-475.

[11] Parry DJ, Raskin RE, Poynter JA, et al. Short and medium term outcomes of surgery for patients with hypertrophic obstructive cardiomyopathy [J]. Ann Thorac Surg, 2015, 99(4): 1213-1219.

[12] 羅亞雄, 石翔, 王福軍. 肥厚型心肌病的研究進(jìn)展 [J]. 中西醫(yī)結(jié)合心血管病電子雜志, 2016, 4(3): 5-8.

[13] Oka T, Akazawa H, Naito AT, et al. Angiogenesis and cardiac hypertrophy: maintenance of cardiac function and causative roles in heart failure [J]. Circ Res, 2014, 114(3): 565-571.

[14] Lu T, Stark GR. NF-κB: regulation by methylation [J]. Cancer Res, 2015, 75(18): 3692-3695.

[15] Yu X, Hong F, Zhang YQ. Cardiac inflammation involving in PKCε or ERK1/2-activated NF-κB signalling pathway in mice following exposure to titanium dioxide nanoparticles [J]. J Hazard Mater, 2016, 313: 68-77.

[16] Jiang C, Tong YL, Zhang D, et al. Sinomenine prevents the development of cardiomyopathy in diabetic rats by inhibiting inflammatory responses and blocking activation of NF-κB [J]. Gen Physiol Biophys, 2017, 36(1): 65-74.

[17] Xu X, Si L, Xu J, et al. Asiatic acid inhibits cardiac hypertrophy by blocking interleukin-1β-activated nuclear factor-κB signalinginvitroandinvivo[J]. J Thorac Dis, 2015, 7(10): 1787-1797.

[18] Zhong P, Wu L, Qian Y, et al. Blockage of ROS and NF-κB-mediated inflammation by a new chalcone L6H9 protects cardiomyocytes from hyperglycemia-induced injuries [J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1852(7): 1230-1241.

[19] Zhang C, Wang F, Zhang Y, et al. Celecoxib prevents pressure overload-induced cardiac hypertrophy and dysfunction by inhibiting inflammation, apoptosis and oxidative stress [J]. J Cell Mol Med, 2016, 20(1): 116-127.

[20] Tham YK, Bernardo BC, Ooi JY, et al. Pathophysiology of cardiac hypertrophy and heart failure: signaling pathways and novel therapeutic targets [J]. Arch Toxicol, 2015, 89(9): 1401-1438.