陳倩 謝旗

（1. 中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所 植物基因組學國家重點實驗室，北京 100101；2. 中國科學院大學，北京 100049）

蛋白質(zhì)是參與生命體代謝、各種信號傳遞、生長發(fā)育的重要大分子，因此，其合成、正常的折疊修飾并根據(jù)信號肽到達發(fā)揮功能的相應(yīng)細胞器也是同樣重要的命題。分泌蛋白和膜蛋白在核糖體上開始合成后很快進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，并在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)繼續(xù)合成新肽鏈以及對新肽鏈進行初步的修飾。然而已有的研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)濃度是100 g/L（大約是2 mmol/L），而一個α螺旋或β折疊正確折疊完成時間是0.1-1 μs，因此，在如此高蛋白濃度的場所進行如此快速的折疊是非常復雜且易錯的［1-2］。為了保證只有正確折疊的蛋白質(zhì)進入高爾基體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中有一個專門負責監(jiān)測蛋白質(zhì)折疊水平的系統(tǒng)，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)（Endoplasmic reticulum quality control，ERQC）［3-4］。如果不能通過 ERQC 的監(jiān)測，蛋白質(zhì)會繼續(xù)留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中并在多種分子伴侶的幫助下進行再折疊，直到達到正確構(gòu)象運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或者被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的降解系統(tǒng)（Endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）降解。積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的錯誤折疊蛋白超出了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)處理的范圍就會造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫（ER stress），而一些外源或者內(nèi)源的脅迫壓力，如植物面臨的冷、熱、鹽和干旱等會加劇ER stress［5-8］。ER stress也會誘導非折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded protein response，UPR），UPR進一步誘導分子伴侶及脅迫相關(guān)基因的表達，幫助細胞度過難關(guān)。

ER stress、ERQC、UPR、ERAD等過程在酵母和動物方面研究較多，已經(jīng)有了被認可的成熟機制。對植物的研究雖然起步較晚，但是近幾年發(fā)展迅速，多個相關(guān)基因及編碼蛋白的功能被一一揭示［9］。在本綜述中，我們將詳細總結(jié)蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的糖基化修飾過程、ERQC、UPR及ERAD識別錯誤折疊蛋白并發(fā)揮功能的過程，以及它們在植物生長發(fā)育過程中的作用。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)（ERQC）

ERQC 的概念最早由 Hurtley和 Helenius［4］在1898年提出，主要涉及監(jiān)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中蛋白質(zhì)的折疊狀態(tài)。蛋白質(zhì)的折疊與初生肽鏈的N-鏈接蛋白質(zhì)糖基化修飾過程息息相關(guān)。加在蛋白質(zhì)初生肽鏈上的糖結(jié)構(gòu)稱為G寡糖，它由兩個葡糖酰胺，9個甘露糖和3個葡萄糖組成（Glc3Man9GlcNAc2）。G寡糖加在肽鏈特定序列（Asn-X-Ser或Asn-X-Thr）的天冬酰胺上，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以及高爾基體一系列酶的作用下剪切成最終結(jié)構(gòu)［10］。

肽鏈上的G寡糖依次經(jīng)過葡萄糖苷酶I和葡萄糖苷酶Ⅱ的酶切作用形成Glc1Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可以被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上類分子伴侶CNX以及其位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中的同源蛋白CRT識別。CNX/CRT能夠大量招募幫助蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶，如蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（Protein disulfide isomerases，PDIs）可以形成或者斷裂分子內(nèi)以及分子間二硫鍵，既保證了蛋白質(zhì)的正確折疊又避免蛋白質(zhì)凝聚。因此，進入CNX/CRT循環(huán)的糖蛋白可以在多種分子伴侶幫助下進行折疊，同時，在CNX/CRT循環(huán)中糖鏈的最后一個葡萄糖繼續(xù)被葡萄糖苷酶Ⅱ剪切［11-12］。如果肽鏈能夠完成正確折疊，則保留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，或被分泌出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入高爾基體；如果肽鏈沒有完成正確折疊，則在UDP葡萄糖糖蛋白糖基轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucose：glycoprotein glucosyltransferase，UGGT）的作用下重新加上一個葡萄糖分子，繼續(xù)在CNX/CRT循環(huán)中進行再折疊［13］。UGGT是一個定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的蛋白，其N端結(jié)構(gòu)可以和非正確折疊的蛋白結(jié)構(gòu)結(jié)合，C端是糖基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域。作為蛋白折疊狀態(tài)的檢測員，UGGT能夠保證蛋白質(zhì)最大可能完成折疊。然而，CNX/CRT并不是無限循環(huán)的，如果蛋白質(zhì)最終仍然不能得到其正確構(gòu)象，蛋白也會從循環(huán)中分離。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)1，2-甘露糖苷酶I和EDEM（酵母中為Htm1）的催化下切掉側(cè)鏈上的兩個甘露糖，形成能被ERAD系統(tǒng)組分OS9識別的α-1，6糖苷鍵，最終錯誤折疊蛋白通過ERAD系統(tǒng)清除［14-15］。到目前為止，錯誤折疊蛋白經(jīng)過多久的再折疊循環(huán)后才從CNX/CRT循環(huán)中脫離還不清楚。

由于其功能的重要性，ERQC系統(tǒng)在高等生物中高度保守。在植物中已經(jīng)鑒定到了多個參與ERQC和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中糖基化修飾相關(guān)的蛋白，并且由于植物要適應(yīng)各種復雜生存環(huán)境，植物中ERQC的同源蛋白數(shù)目一般不止一個。在擬南芥中，CNX有兩個拷貝，而CRT有3個同源蛋白。研究顯示，在正常生長條件下，cnx1 cnx2雙突變體以及crt1 crt2 crt3三突變體均沒有明顯表型，而cnx1 crt1 crt2 crt3四突變體表現(xiàn)出植株矮小，主根變短，根毛變密以及花粉活力變差，花粉管生長異常等表型。但是有意思的是，cnx2 crt1 crt2 crt3并沒有表現(xiàn)出類似的表型，但是CNX2能夠恢復cnx1 crt1 crt2 crt3突變體一系列生長異常的表型。說明CNX1和CNX2存在功能冗余，但是CNX1比CNX2作用更強。如果CNX/CRT循環(huán)中的5個基因同時功能缺失，則會導致植物致死［16］。植物甾醇受體BRI的突變體形式bri1-9和bri1-5被證實是ERAD的底物，正常的BRI蛋白在質(zhì)膜上接受信號，而突變形式的bri1-9和bri1-5積累在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，導致植物出現(xiàn)生長矮小的表型［17］。如果ERAD途徑受阻，大量的bri1-9/ bri1-5在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累并溢出到質(zhì)膜，接收信號后植物能夠恢復表型。通過篩選恢復bri1-9矮小表型的基因，篩選到了CRT3，crt3 bri1-9雙突變體能夠很好地恢復bri1-9 生長矮小的表型［18］。

UGGT在擬南芥中只有一個同源蛋白，uggt突變體植物中以UDP-葡萄糖為底物的糖基轉(zhuǎn)移酶活性明顯下降，同時突變體植物表現(xiàn)出明顯的生長矮小，主根變短表型。在uggt突變體中，BiP1/2、BiP3、PDIL等UPR響應(yīng)基因的表達明顯上調(diào)，說明在沒有外源ER stress時，UGGT突變能夠誘導UPR 的產(chǎn)生［19］。

哺乳動物中α-甘露糖苷酶EDEM在擬南芥中的同源家族有5個成員，分別稱為MNS1-5，其中MNS1和MNS2是高爾基體甘露糖苷酶，MNS3是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)甘露糖苷酶，在MNS1/2的上游發(fā)揮作用。在MNS1-3的作用下，寡糖由Man9GlcNAc2結(jié)構(gòu)剪切為 Man5GlcNAc2結(jié)構(gòu)［20］。MNS4和 MNS5是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的蛋白質(zhì)，對折疊正確的分泌蛋白上的甘露糖沒有作用，通過煙草瞬時表達實驗發(fā)現(xiàn)，它們能夠順利剪切內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留的錯誤折疊糖蛋白上的甘露糖，產(chǎn)生被ERAD系統(tǒng)識別的α-1，6糖苷鍵，說明MNS4和MNS5參與擬南芥ERQC過程［21］。同時，mns4 mns5突變體表現(xiàn)出對鹽脅迫處理敏感的表型。植物中越來越多的研究使得植物蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的加工折疊過程越來越明朗，其中大部分過程和酵母，動物中的研究是高度保守的。

2 非折疊蛋白應(yīng)答（UPR）

錯誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的大量積累會誘導UPR的產(chǎn)生。UPR過程也是酵母、動物以及植物領(lǐng)域保守存在但具體的作用機制又有所差異的。酵母中的UPR只有一條通路，由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白 IRE1p（Inositol-Requiring Transmembrane Kinase/Endonuclease p）介導。在動物UPR中除了IRE1外還存在另外兩條通路，分別是ATF6和PERK通路。熱激蛋白HSP70家族成員BiP起著調(diào)控3個跨膜受體活性的作用。BiP蛋白由N端的ATP酶活結(jié)構(gòu)域和C端的肽段結(jié)合結(jié)構(gòu)域組成，其與錯誤折疊蛋白暴露的疏水殘基之間的結(jié)合受ATP酶活調(diào)控。在沒有受脅迫的細胞中，BiP和這3個受體結(jié)合，抑制它們的活性；而在受到脅迫時，BiP即與3個受體解離，受體被激活［22-23］。

IRE1是一個約100 kD的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜定位蛋白，該蛋白主要由核糖核酸酶結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域組成，在動物中存在兩個同源蛋白，分別是IRE1α和IRE1β。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的部分與BiP相互作用并在受到脅迫時解離。解離以后 IRE1 首先通過自身激酶活性進行自身磷酸化，進而形成同源二聚體，完成自身激活。激活的 IRE1 通過其核糖核酸酶活性剪切掉XBP1u中一個約26個核苷酸的內(nèi)含子，形成XBP1s，通過XBP1s發(fā)揮緩解ER stress的功能［24］。另一方面，近來的研究顯示，沒有脅迫出現(xiàn)時，IRE1α作為ERAD底物被調(diào)控，并且BiP參與了該過程［25］。脅迫出現(xiàn)后，BiP與IRE1α解離，IRE1α蛋白質(zhì)穩(wěn)定性增強，發(fā)揮UPR功能。以上研究說明BiP可以從活性和蛋白質(zhì)穩(wěn)定性兩方面調(diào)控IRE1α［25］。

ATF6 是一個90 kD大小的蛋白，定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。在動物中也存在兩個同源蛋白，分別是ATF6α 和 ATF6β。研究認為 ATF6α 在緩解 ER stress中發(fā)揮著更重要的作用。與IRE1類似，在沒有脅迫時，ATF6和BiP相互作用；一旦出現(xiàn)脅迫，BiP與ATF6解離，ATF6激活且定位從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體中。ATF6 在高爾基體中接受進一步的膜內(nèi)蛋白剪切，首先被絲氨酸蛋白酶位點1（S1P）剪切，隨后被金屬蛋白酶位點2（S2P）剪切。經(jīng)過兩步剪切，ATF6 由原來的90 kD變成只具有50 kD大小轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的蛋白并進入細胞核中，通過調(diào)控 UPR 相關(guān)基因或者 ERAD 組分基因的表達，發(fā)揮緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脅迫的作用［26］。

PERK的激活類似于IRE1，也是與BiP解離后形成二聚體并自我激活。活化后的PERK可以進一 步 磷 酸 化 eIF2α（Eukaryotic translation Initiation Factor 2α），磷酸化的eIF2α繼續(xù)保持與eIF2B的結(jié)合因而不能與GDP結(jié)合，造成翻譯不能正常進行。因此，減少了進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白量，達到緩解ER stress的目的［27］。

植物中的UPR主要有兩條通路，一條是類似于IRE1的bZIP60轉(zhuǎn)錄因子介導的通路，另外一條是類似于ATF6的bZIP28轉(zhuǎn)錄因子介導的通路。目前植物中還沒有動物中PERK同源基因被報道，但是除了膜定位的bZIP類轉(zhuǎn)錄因子外，植物特有的NAC轉(zhuǎn)錄因子也參與到緩解ER stress中。2011 年，Deng等［7］發(fā)現(xiàn)Tm和DTT等ER stress誘導劑可以誘導bZIP60發(fā)生mRNA剪切。bZIP60的mRNA在跨膜域上游被剪切掉23 bp，新組合序列編碼的蛋白在剪切識別位點下游有兩個預(yù)測的核定位信號［7］。進一步研究發(fā)現(xiàn)IRE1在bZIP60的剪切中發(fā)揮功能。IRE1在擬南芥中有兩個同源蛋白，分別稱為IRE1a和 IRE1b。Nagashima等［28］發(fā)現(xiàn)在 ire1b單突變體中bZIP60的剪切幾乎不受影響；而在ire1a/ire1b雙突變體中，bZIP60的剪切完全消失，說明植物中IRE1a和IRE1b在負責bZIP60的剪切上存在功能冗余。bZIP60和XBP1序列同源性不高，但都具有雙莖環(huán)結(jié)構(gòu)，對其成功剪接非常重要。

與bZIP60在mRNA水平進行活化不同，bZIP17/28在蛋白質(zhì)水平進行活化。bZIP17/28 均是定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的轉(zhuǎn)錄因子，與 ATF6 序列相似性雖然不高，但是在結(jié)構(gòu)域排列上有相似性。例如，在朝向細胞質(zhì)側(cè)的N端有一個預(yù)測的bZIP結(jié)構(gòu)域，并且在朝向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的C端有一個S1P酶切位點。bZIP17和bZIP28的作用機制相似，以下以bZIP28為例來說明。與 ATF6 不同，bZIP28 的激活雖然也受到了 BiP 的影響，但是并不直接與 BiP 相關(guān)。正常情況下，bZIP28 通過與 BiP 相互作用滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。當體內(nèi)錯誤折疊的蛋白積累時，這些錯誤折疊蛋白競爭性的與 BiP 相互作用，因此使bZIP28從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)得到釋放［29-31］。而bZIP28本身在細胞質(zhì)側(cè)靠近跨膜域的部分，以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)均有高爾基體定位信號［32-33］。當被釋放的bZIP28從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)移到高爾基體后被S1P和S2P兩個酶剪切，使包含DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域的蛋白胞質(zhì)側(cè)從膜系統(tǒng)脫離進入細胞核，調(diào)控相應(yīng)脅迫響應(yīng)基因的表達［34-36］。研究顯示不僅TM和DTT這類典型的ER stress誘導物能誘導bZIP28的活化途徑，環(huán)境脅迫比如熱脅迫也能夠發(fā)揮作用［37-39］。此外，鹽脅迫能夠誘導bZIP17發(fā)生類似的活化過程［5］。

NAC 類轉(zhuǎn)錄因子是植物中特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。近期研究表明，NAC062和NAC089均可以受到ER stress的誘導表達，面對ER stress，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的NAC089和質(zhì)膜定位的NAC062會轉(zhuǎn)移到細胞核內(nèi)，在植物的 UPR 中發(fā)揮重要作用［40-41］。它們均是二類單次跨膜膜蛋白，與bZIP28在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)還有大的蛋白結(jié)構(gòu)域不同，NAC062和NAC089僅通過C末端插在膜上，功能結(jié)構(gòu)域均位于胞質(zhì)側(cè)。因此目前關(guān)于二者是如何定位到細胞核的具體機制還不甚清晰。CHIP-qPCR結(jié)果顯示NAC062在一些UPR響應(yīng)基因如BiP2的啟動子區(qū)域富集。下調(diào)體內(nèi)NAC062時，植物表現(xiàn)對脅迫敏感，而在bzip28/bzip60雙突背景下過表達核定位的NAC062DMyc時植物對脅迫表現(xiàn)出抗性［41］。冷脅迫也可以誘導NAC062的核定位［42］。關(guān)于植物體內(nèi)的UPR系統(tǒng)除了膜相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子外可能還有更多蛋白參與其中，相信隨著研究的深入會有更多參與因子被發(fā)掘，同時，更詳細的功能機制也會被解析。

為了緩解 ER stress，直接將錯誤折疊蛋白清除對于生物體同樣至關(guān)重要。那么接下來就介紹參與這個過程的重要因子：ERAD和ERQC autophagy。這兩個途徑的主要區(qū)別是ERAD機制將錯誤折疊蛋白底物反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)然后進行泛素化修飾，最后通過細胞質(zhì)的26S蛋白酶體清除［43］；而集聚在一起不能被反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中的錯誤折疊蛋白或者不能被ERAD降解的蛋白質(zhì)則通過ERQC autophagy途徑降解［44-45］。首先總結(jié)ERAD途徑的研究進展。

3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的蛋白質(zhì)降解

ERAD 系統(tǒng)有效的行使其功能對于細胞正常的生命活動非常重要［43，46］。在人中，ERAD 與一些疾病相關(guān)，如帕金森綜合癥。Parkin 蛋白是一個 RING-type 的 E3 連接酶，家族性帕金森綜合癥患者的致病原因之一是 Parkin 蛋白的突變，突變的Parkin 喪失了 E3 活性，不能有效緩解錯誤折疊蛋白積累造成的脅迫，這種脅迫持續(xù)的積累會產(chǎn)生神經(jīng)毒性，從而造成帕金森綜合癥［47］。植物中ERAD也與耐受逆境脅迫過程有關(guān)，研究工作表明用300 mM NaCl處理野生型擬南芥6 h后，BiP、CNX1的表達量均明顯上調(diào)［48］。除了在降解這些錯誤折疊蛋白中發(fā)揮作用外，研究顯示ERAD在正常的生長發(fā)育過程中也發(fā)揮著重要的作用。哺乳動物中，UBE2J1功能缺失會導致小鼠精子發(fā)育缺陷，從而影響生育［49］。同樣在小鼠體內(nèi)敲除SEL1L，能夠引起小鼠體內(nèi)脂類代謝的異常，最終導致小鼠體重下降［50］。而在植物當中，通過比較番茄成熟缺陷突變體rin和野生型差異表達蛋白發(fā)現(xiàn)了一個與酵母ERAD中Ubc6p同源的番茄UBC32，該基因的功能缺失導致番茄果實晚熟［51］。綜上所述，ERAD過程中的組分蛋白既可以在外界脅迫存在的情況下，通過降解錯誤折疊蛋白來緩解ER stress，同時也在動植物的正常生長發(fā)育中發(fā)揮重要功能。

ERAD過程主要由四步組成：（1）對錯誤折疊蛋白的識別；（2）位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白質(zhì)反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)；（3）在特定的E1，E2和E3連接酶作用下進行泛素化修飾；（4）由26S蛋白酶體降解。對錯誤折疊蛋白的識別主要涉及兩種，一種是對錯誤折疊糖蛋白的識別，這種識別主要依賴于糖蛋白經(jīng)過剪切后暴露的α-1，6糖苷鍵。OS9（植物中是AtOS9）結(jié)合α-1，6糖苷鍵后通過與SEL1L（植物中HRD3A）互作將底物拉進HRD1復合體。另一種是對非糖蛋白的識別，通過BiP識別錯誤折疊蛋白暴露的疏水肽段完成。蛋白與BiP結(jié)合后并不進入CNX/CRT循環(huán)，而是被其傳遞給二硫鍵還原酶ERdj5，進而傳遞給SEL1L進入ERAD系統(tǒng)［52-53］。如果將糖蛋白的糖鏈加工過程進行人為抑制，那么糖蛋白也會通過BiP識別進入ERAD降解系統(tǒng)［52］。擬南芥中已證實AtOS9參與ERAD過程，atos9突變體表現(xiàn)出對鹽脅迫和衣霉素處理敏感的表型，并且atos9 bri1-9/ atos9 bri1-5能夠恢復bri1-9/ bri1-5生長矮小的表型。但是AtOS9并不能恢復酵母中OS9p對于底物CPY*的降解，說明植物中和酵母中OS9在介導不同的底物中發(fā)揮作用［54-55］。

大部分經(jīng)過ERAD系統(tǒng)清除的錯誤蛋白都是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔蛋白或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白，這部分蛋白需要轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中才能被細胞質(zhì)中的蛋白酶體降解。目前關(guān)于反轉(zhuǎn)運通道研究成熟的主要有3種。一種是SEC61轉(zhuǎn)運通道，關(guān)于SEC61，我們更熟悉的是其作為通道介導分泌蛋白進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。但是酵母和動物中的研究表明缺失SEC61可以使多個ERAD底物蛋白，如酵母配對信息素pαF、細菌毒素的催化亞基等穩(wěn)定性增強［56-57］。此外，酵母中的DER1（動物中為Derlin1）也認為在底物轉(zhuǎn)運中發(fā)揮重要功能。DER1缺失可以完全阻止CPY*和PrA*的降解［58］。但是DER1只有四個跨膜域，很難單獨發(fā)揮通道功能，因此更認為它作為通道的重要組成部分。第三種通道即是介導底物蛋白泛素化修飾的E3連接酶，研究表明HRD1通常通過跨膜域與底物蛋白互作，并介導底物蛋白的反轉(zhuǎn)運［59-60］。擬南芥中的E2 UBC32是HRD1的底物，研究顯示UBC32與HRD1互作即是通過跨膜域?qū)崿F(xiàn)［61］。

反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)后即進行底物的泛素化修飾。有一類特殊的E2和E3介導ERAD底物的降解。在酵母中有兩個E3連接酶，分別為Hrd1p和Doa10p，E2分別有Ubc6p和Ubc7p。動物中目前已經(jīng)報道的參與ERAD的E3有16個，而Ubc6p在人類細胞中的同源蛋白有UBE2J1和UBE2J2；Ubc7p在人類細胞中的同源蛋白有UBE2G1和UBE2G2。植物中已經(jīng)報道的有E3連接酶HRD1、DOA10及Rma1，接頭蛋白HRD3A，泛素結(jié)合酶UBC32等。HRD1復合體中的HRD1蛋白，HRD3A以及AtOS9在擬南芥中均已有報道。HRD1在擬南芥中有兩個功能冗余的同源蛋白HRD1A和HRD1B。雙突變體表現(xiàn)出衣霉素處理敏感的表型，并且HRD1通過直接介導UBC32的泛素化參與ERAD活性的調(diào)節(jié)［61］。hrd3a突變體對鹽、百草枯等一系列處理均是超敏感的，并且突變體體內(nèi)積累更多的ROS［48］，在其突變體中過表達UPR相關(guān)基因bZIP17，bZIP28，bZIP60可以彌補hrd3a突變造成的脅迫表型［62］。通過篩選干旱敏感突變體dry2的抑制子得到SUD1（Suppressor of dry2 defects1），SUD1即酵母中Doa10p的同源蛋白。突變的DOA10（SUD1）能夠顯著恢復dry2干旱敏感的表型，但是DOA10只能下調(diào)羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMG-CoA）的活性并不影響HMGCoA的蛋白穩(wěn)定性［8］。此外，doa10突變體在ABA上表現(xiàn)出超敏感表型，突變體干種子中的ABA含量明顯增高，添加ABA抑制劑后突變體表型得到恢復。因此，DOA10是ABA合成和信號通路中的負調(diào)控因子［63］。而最近又有研究報道doa10hrd1ahrd1b三突變體對熱激處理表現(xiàn)不敏感表型［64］。已報道的動物中參與ERQC、UPR、ERAD相關(guān)基因在擬南芥中的同源基因見表1，相信隨著植物領(lǐng)域ERAD研究的深入，越來越多的ERAD組分以及這些組分參與的生物學過程被發(fā)掘。

鑒于ERAD系統(tǒng)如此重要，ERAD活性受到了生命體的精細調(diào)控。如果體內(nèi)的 ERAD 活性紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的 ERAD 組分含量過高，當ERAD 總體活性過高時，就會非特異性的識別一些蛋白折疊中間體，將這些正在折疊中的蛋白作為錯誤折疊蛋白降解，這顯然對生物體是不利的。在這種情況下，細胞通過降解體內(nèi) ERAD 組分使 ERAD 活性保持在一個較低水平，進而保證細胞內(nèi)的蛋白正確折疊的過程，這種機制就稱為 ERAD平衡（ERAD tuning）［65］。被調(diào)控的這些 ERAD組分本身又是發(fā)揮功能的組分，如果細胞遭受外來侵害而使細胞內(nèi)錯誤折疊蛋白增多，這些蛋白又會穩(wěn)定下來發(fā)揮其相應(yīng)的功能。因此，ERAD tuning 活性是受體內(nèi)錯誤折疊蛋白水平調(diào)控的。但是目前脅迫使 ERAD 組分穩(wěn)定的具體機制研究還非常少見。一種假設(shè)認為，錯誤折疊蛋白可能在這個過程中起到重要作用。在錯誤折疊蛋白很少的情況下，ERAD 組分大部分處于未組裝的狀態(tài)，因此使某些組分被降解；而大量錯誤折疊蛋白存在時，可以促使 ERAD 組分組裝，形成有功能的ERAD 機器，同時保護那些原來被降解的組分不再被降解。最近一篇關(guān)于 HRD1 介導IRE1 降解的文章介紹，脅迫可以很大程度上減弱HRD1 與 IRE1 之間的相互作用。另外，脅迫處理與不處理條件下，胰蛋白酶對 IRE1 的剪切帶型也不同，因此，作者認為脅迫可能從影響蛋白相互作用和改變構(gòu)象兩方面使 ERAD 組分穩(wěn)定［24］。脅迫消除后，被過量誘導表達的各種伴侶分子和 ERAD 組分需要被清除掉，分子伴侶的消除時間更長，如 PDI、BIP、CNX 等的半衰期均大于 24 h。而 ERAD 組分的消除時間相對較快。因此，ERAD tuning 在面對脅迫時對 ERAD 活性的調(diào)節(jié)相比UPR更加迅速，同時UPR一部分下游基因編碼ERAD相關(guān)蛋白。但是目前關(guān)于ERAD平衡的研究還很少。Chen等［61］最近發(fā)現(xiàn)UBC32的蛋白穩(wěn)定性受脅迫處理的調(diào)控，在沒有脅迫時HRD1可以直接介導UBC32通過蛋白酶體途徑降解；脅迫處理時，UBC32穩(wěn)定性增強。并且HRD1對UBC32的調(diào)控在動物細胞中保守存在。同時，他們還發(fā)現(xiàn)UBC32可以負調(diào)控HRD1復合體中的AtOS9，通過相互調(diào)控實現(xiàn)ERAD活性的平衡［66］。而這個結(jié)果也和動物中OS9在UBE2J1突變體中積累的結(jié)果是一致的，說明ERAD平衡像ERAD過程一樣在高等生物中保守存在。

4 ERQC自噬途徑（autophagy）

很多內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的蛋白由于本身是膜蛋白，多個蛋白分子集聚到一起后體積較大，不能反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中由蛋白酶體來降解，這些蛋白一般由另外一種重要的調(diào)控蛋白穩(wěn)定性的途徑——自噬途徑降解。但是目前植物中相關(guān)領(lǐng)域研究還很少，動物中有較多報道，如α1抗胰蛋白酶Z（ATZ）是α1抗胰蛋白酶的一個點突形式，ATZ能夠影響蛋白的正常糖基化，形成不可溶的聚集體。由于其不能反轉(zhuǎn)運到細胞質(zhì)中，因此會通過類內(nèi)吞的作用形成自噬體，進而通過自噬途徑降解。這個過程不需要泛素化修飾，也沒有ERAD相關(guān)組分參與［67］。Houck等［45］在2014年報道某些蛋白是可溶的，但是由于其不能被ERAD底物識別系統(tǒng)識別，也會通過ERQC autophagy途徑降解。如一種G蛋白偶聯(lián)受體GnRHR，其部分折疊的突變形式E90K在蛋白酶體抑制劑處理時不受影響，而在自噬途徑抑制劑處理時蛋白積累。作者認為這是因為部分錯誤折疊使ERAD識別系統(tǒng)不能很好地識別該底物，從而誘導了自噬途徑。完全錯誤折疊的突變體蛋白S168R主要是通過蛋白酶體途徑降解，但是如果將ERAD途徑阻止，S168R就會進入ERQC autophagy途徑。以上兩種自噬都是不依賴于泛素化修飾的，而有一類選擇性自噬途徑依賴于泛素化修飾，然后由一個中間受體介導進入自噬途徑。這個中間受體需要同時具有泛素結(jié)合域和LC3（定位于自噬體）結(jié)合域，目前已經(jīng)知道的有SQSTM1/P62，NBR1等。2017年Feng等［68］報道HRD1可以介導SERPINAE342K進行K48位的泛素化修飾，部分通過蛋白酶體途徑降解，而另外大部分則通過SQSTM1/P62介導的選擇性自噬途徑降解。

研究顯示在擬南芥中ER stress可以誘導自噬過程，進而造成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜及內(nèi)含物的降解。其中IRE1b在該過程中發(fā)揮重要作用，而同源基因IRE1a沒有此作用［69］。進一步研究揭示了ER stress造成的積累的錯誤折疊蛋白作為信號激活了自噬過程［70］。雖然目前植物領(lǐng)域這部分詳細的報道還較少，但是鑒于植物領(lǐng)域近幾年的蓬勃發(fā)展我們相信在不久的將來肯定會有更多相關(guān)報道。圖1總結(jié)了動植物中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量檢測系統(tǒng)過程。

圖1 動植物中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)質(zhì)量監(jiān)控系統(tǒng)

5 展望

目前關(guān)于ERAD的研究仍然是酵母和動物領(lǐng)域研究的最詳盡，植物中的相關(guān)研究是近幾年才逐漸增多。植物整個生命過程中受到精細的激素調(diào)控，同時也會遭受各種生物或非生物脅迫，解析ERAD如何在植物面對脅迫時發(fā)揮功能是非常重要的。雖然已經(jīng)報道ERAD參與鹽脅迫，熱脅迫以及ABA信號通路等過程，但是距離解析ERAD在更多脅迫或者激素信號中詳細的作用機理還有很大距離。此外，自噬途徑與ERAD介導的蛋白酶體途徑在介導底物降解之間的協(xié)同合作方面的研究在植物領(lǐng)域也知之甚少，值得科學家投入更多精力進行研究，對這些問題的深入研究將有助于我們進一步揭示ERAD調(diào)控植物生長發(fā)育的奧秘。

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