官麗莉 崔琪 李聲釗 董程 李海龍 彭建豪 李校堃

（1. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130118；2. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生物反應(yīng)器與藥物開發(fā)教育部工程研究中心，長(zhǎng)春 130118）

自然界幾乎所有生物群體體內(nèi)中都含有防御素，而天然防御素是由自身進(jìn)行長(zhǎng)期的抗逆斗爭(zhēng)進(jìn)化而來，并逐漸成為免疫系統(tǒng)必不可少的成分之一。植物防御素廣泛分布在植物的根、莖、葉、果實(shí)、塊莖和種子中，可抑制殺死多種病原真菌，因此可用來研制新型的殺菌劑或新型的抗生素類藥物。目前，在植物防御素的結(jié)構(gòu)、功能和抗真菌機(jī)制等方面都已取得了較大的研究進(jìn)展，但有關(guān)于植物防御素抗腫瘤、抑制酶活、作為離子阻斷劑等相關(guān)機(jī)制還值得更深入的研究。

1 植物防御素概述

1.1 植物防御素的發(fā)現(xiàn)與發(fā)展

1966年，Zeya等［1］首次于哺乳動(dòng)物老鼠和豚鼠的多形核的嗜中性白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了防御素，稱其為“溶酶體陽離子蛋白”。1985年，Robert等［2］首次對(duì)防御素進(jìn)行了定義，即用來闡述存在于人體中的嗜中性白細(xì)胞內(nèi)的一類抗惡性細(xì)胞和廣譜微生物的離子肽。1989年，法國學(xué)者Hoffmann等［3］對(duì)昆蟲進(jìn)行研究，從中分離純化得到與兔子肺吞噬細(xì)胞防御素同源的昆蟲防御素。與哺乳動(dòng)物和昆蟲防御素相比，植物防御素的發(fā)現(xiàn)相對(duì)較晚。1990年，Mendez等［4］首次從小麥、大麥種子中分離提純并得到具有防御作用的離子肽 r1-P和 r1-H。1995年，Terras等［5］從胡蘿卜種子中分離純化得到一個(gè)長(zhǎng)度為5 kD新的富含半胱氨酸的抗真菌蛋白家族（Antifungal Proteins，AFPs），鑒于它們的高級(jí)結(jié)構(gòu)與哺乳動(dòng)物、昆蟲防御素類似，這種分子量較小的防御相關(guān)蛋白被正式命名為植物防御素。

最初研究表明，植物防御素只存在特定植物的種子中。但是經(jīng)過十幾年的研究，科學(xué)家們證實(shí)了植物防御素存在于每個(gè)植物的不同器官和組織中。研究表明植物防御素在番茄［6］、結(jié)球白菜［7］、白色蕓豆［8］、甘藍(lán)型油菜［9］等植物生長(zhǎng)發(fā)育、生理代謝中具有重要作用。

1.2 植物防御素的結(jié)構(gòu)

目前為止，植物中提取的植物防御素有數(shù)百種之多，雖然不具有完全相同的的結(jié)構(gòu)，但其大體結(jié)構(gòu)基本相類似?？梢愿爬椋褐参锓烙厥且活愋⌒偷碾x子多肽，包含45-54個(gè)氨基酸殘基，含有半胱氨酸（Cys）穩(wěn)定的αβ模序（Cysteine-stabilized alpha beta motif，Csαβ）［10］（圖 1），其中保守半胱氨酸殘基8個(gè)，且這8個(gè)半胱氨酸形成4對(duì)二硫鍵，其三維結(jié)構(gòu)呈小球形，包括1個(gè)α-螺旋和3個(gè)β-折疊片層結(jié)構(gòu)。其中含有的4 對(duì)二硫鍵連接方式分別為：Cys1-Cys8、Cys2-Cys5、Cys3-Cys6和Cys4-Cys7。

隨著研究進(jìn)一步深入，逐漸從不同植物的花器官中發(fā)現(xiàn)有些植物防御素一級(jí)結(jié)構(gòu)中不僅含有N端酸性信號(hào)肽，還含有額外結(jié)構(gòu)域。例如，研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育中玉米籽粒防御素ZmESR6，含有額外的酸性C末端結(jié)構(gòu)域。目前此附加結(jié)構(gòu)域具體功能尚不清楚，但推測(cè)它在中和毒性蛋白中發(fā)揮重要作用。從最初擬南芥中提取的15種植物防御素中發(fā)現(xiàn)AtPDF3.1和AtPDF3.2的序列在信號(hào)肽和成熟防御素結(jié)構(gòu)域之間含有富含酸性半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域，目前仍然需要確定此額外的結(jié)構(gòu)域是否屬于前結(jié)構(gòu)域，是否潛在地參與靶向或在蛋白質(zhì)合成期間起到中和潛在的毒性堿性效應(yīng)物的作用。

當(dāng)然也存在一些特殊結(jié)構(gòu)的植物防御素，林軍岳等［11］通過相關(guān)的預(yù)測(cè)軟件 I-TASSER發(fā)現(xiàn)，手掌參植物防御素Gcthionin的二硫鍵排布與其他植物防御素相比有其自身的特異性，除了Cys3與 Cys47，Cys14與 Cys34，Cys24與Cys43形成3對(duì)二硫鍵外，兩個(gè)游離巰基Cys20與Cys41未形成二硫鍵（圖 2）。

圖1 植物防御素的三級(jí)結(jié)構(gòu)示意圖

1.3 植物防御素的分類

1.3.1 按結(jié)構(gòu)分類 雖然植物防御素的基因序列具有較高的保守性，但是總的來說組成植物防御素的氨基酸平均保守性非常差，僅限于在11位置上的芳香族殘基、13位置的甘氨酸殘基、29位置的谷氨酸殘基。所以根據(jù)氨基酸保守性進(jìn)行分類就顯得不是很現(xiàn)實(shí)。李鑫等［12］對(duì)115種植物防御素序列進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)，氨基酸序列具有較高的同源性。因此根據(jù)成熟序列差異可將防御素分為兩大類，與擬南芥PDF1家族同源性較高的植物防御素被歸為第一類，與擬南芥PDF2家族同源性較高的植物防御素被歸為第二類。據(jù)研究，其中絕大多數(shù)植物防御素屬于第二類。一些較特殊的被歸為第一類，包括番茄、耬斗花中的各一個(gè)基因與蒺藜苜蓿、油菜中的多個(gè)防御素基因。

圖2 Gcthionin與典型植物防御素二硫鍵排布的比對(duì)

1.3.2 按結(jié)構(gòu)和功能結(jié)合分類 早在1998年Segura等［13］就根據(jù)植物防御素成熟序列的差異和抗真菌活性的不同，將其進(jìn)行了分類。包括兩大類和4個(gè)亞族，其中每大類中都包含兩個(gè)亞族。因第一亞族和第二亞族具有較高同源性被歸為第一大類，第三亞族和第四亞有較高同源性族被歸為第二大類。第一亞族包括能致使大刀鐮刀菌屬（Fusarium culmorum）菌絲產(chǎn)生多分支且能誘導(dǎo)菌絲體體尖端膨大生長(zhǎng)的植物防御素。第二亞族包含對(duì)菌絲多分枝生長(zhǎng)無作用但能抑制大刀鐮刀菌屬菌體生長(zhǎng)的植物防御素。第三亞族包含除了能抑制毛盤孢菌（Colletotrichum lagenarium）、大刀鐮刀菌屬等絲狀真菌生長(zhǎng)外，還能抑制格蘭氏陰陽性細(xì)菌生長(zhǎng)的植物防御素。第四亞族包含對(duì)病原體無抗真菌作用的植物防御素。

1.4 植物防御素的功能

1.4.1 抗菌作用 大部分植物防御素都具有抗真菌的作用，其抑制真菌的IC50范圍為0.1 μmol/L到6.2 μmol/L（但也取決于不同真菌種類和不同來源的植物防御素）［14］。例如，胡蘿卜種子植物防御素RsAFP2抑制稻瘟病菌的活性IC50僅為0.1 μmol/L就可以達(dá)到良好的效果（表1）。當(dāng)然也有一部分具有抗細(xì)菌的作用但是并沒有抗真菌那么強(qiáng)烈，其 IC50一般要達(dá)到100 μmol/L以上。

1.4.2 抗腫瘤作用 抑制腫瘤細(xì)胞增殖是植物防御素倍受人們關(guān)注的原因之一。已發(fā)現(xiàn)有多種植物防御素具有抗腫瘤作用，如田豆類植物防御素Sesquin對(duì)白血病細(xì)胞株L1210和M1細(xì)胞株的繁殖抑制率為80%［16］、風(fēng)輪菜防御素對(duì)人Hela癌細(xì)胞株抑制率為80%［16］、利馬豆中防御素Limyin對(duì)人肝癌細(xì)胞株 Bel-7402 和人膠質(zhì)細(xì)胞瘤 SHSY5Y 的 IC50濃度分別是 43 μmol/L 和 28 μmol/L［17］。

表1 植物防御素抗真菌活性IC50值（μmol/L）［15］

1.4.3 抑制酶的活性 有些植物防御素是酶活性的抑制劑，如大麥植物防御素能抑制蛋白質(zhì)的翻譯過程；綠豆的防御素VrD1在昆蟲飼料中含量為0.2%時(shí)就能抑制昆蟲α-淀粉酶的活性導(dǎo)致昆蟲消化系統(tǒng)受損而死亡［18］；臘腸樹種子防御素5459具有抑制胰蛋白酶活性的作用［19］。

1.4.4 其他活性 植物防御素還有一些其他功能，如玉米種子防御素 γ1-zeathionin 和 γ2-zeathionin 可作為離子阻斷劑，能抑制哺乳動(dòng)物細(xì)胞GH3的電壓門鈉離子通道，其抑制鈉離子電流的 IC50分別是62 μmol/L 和 33 μmol/L［20］；菜豆防御素 PvD1可抑制亞馬遜什曼原蟲的生長(zhǎng)［21］；擬南芥防御素 AhPDF1.1可增強(qiáng)酵母對(duì)鋅的耐受性等。

2 植物防御素的抗菌機(jī)理

植物防御素可作為最直接的作用就是抗菌作用，到目前為止其抗真菌機(jī)理也較為清晰。關(guān)于抗菌機(jī)理主要有以下4種解說：（1）植物防御素與真菌特異性質(zhì)膜組分相互作用（2）植物防御素被攝取并識(shí)別細(xì)胞內(nèi)特異性受體（3）植物防御素活化下游信號(hào)傳導(dǎo)途徑（4）易感酵母的耐受機(jī)制和真菌物種對(duì)植物防御素活性影響［22-23］（圖 3）。

植物防御素可與真菌特異性質(zhì)膜組分結(jié)合，導(dǎo)致病原菌細(xì)胞膜凹陷，嵌入細(xì)胞膜或轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞膜內(nèi)，進(jìn)而發(fā)生一系列的生物化學(xué)變化。即植物防御素與動(dòng)物防御素和昆蟲防御素的抗菌機(jī)理不同，并非直接與病原體表面受體發(fā)生作用而使細(xì)胞膜的通透性改變，從而造成膜內(nèi)外化學(xué)電勢(shì)差的改變來達(dá)到抗菌作用［24］。如10多年前，第一份研究報(bào)道植物防御素抗菌機(jī)制是其與真菌細(xì)胞膜上的復(fù)雜的含有鞘脂的肌醇磷酸（Inositol phosphoryl-containing sphingolipids，M（IP）2C）和葡糖苷（脂）酰鞘氨醇（Glucosylceramides，GlcCer）相結(jié)合，這些鞘脂不僅是真核細(xì)胞膜的重要組成成分，還作為第二信使調(diào)節(jié)細(xì)胞生存和死亡的微妙平衡。GlcCer不僅僅分布在真菌細(xì)胞膜上，也分布在真菌細(xì)胞壁中［25］，說明植物防御素也可以對(duì)細(xì)胞壁起殺傷作用。

對(duì)植物防御素殺死真菌的研究證明了GlcCer的重要作用，并證實(shí)的有5種不同的植物防御素，即煙草防御素 NaD1［26］、蘿卜防御素 RsAFP2［27］、蒺藜苜蓿防御素 MsDef1［28］、禾草防御素 Sd5［29］和豌豆 防 御 素 PsD1［30］。NaD1、RsAFP2、MsDef1、Sd5和PsD1都是與細(xì)胞壁上GlcCer相結(jié)合而發(fā)揮作用，不同的是MsDef1和sd5與之結(jié)合卻不被吸收，而RsAFP2、NaD1和PsD1被吸收到易感真菌的細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生一系列變化從而導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)被破壞甚至細(xì)胞死亡［31］，如 Aerts等［32］報(bào)道，蘿卜防御素 RsAFP2與白念珠細(xì)胞GlcCer相互作用后，導(dǎo)致胞內(nèi)活性氧ROS值升高，從而激活胞內(nèi)胱天冬蛋白酶或半胱天冬蛋白酶來引起真菌細(xì)胞凋亡；芥菜防御素HsAFP1可導(dǎo)致胞內(nèi)ROS值升高并直接誘導(dǎo)真菌凋亡；豌豆防御素PsD1可導(dǎo)致細(xì)胞周期的變化而誘導(dǎo)真菌凋亡（圖3-A）。

同時(shí)為了保護(hù)自己免受植物防御素的影響，病毒、易感酵母和真菌會(huì)有各種各樣的阻斷機(jī)制。如Hs AFP1耐受基因，就可牽連MAPK通路發(fā)揮關(guān)鍵作用，在不同的環(huán)境中維持細(xì)胞壁完整性的作用［33］。該誘導(dǎo)途徑在極化生長(zhǎng)條件下（受到熱、低滲透壓、細(xì)胞壁損傷和氧化應(yīng)激）才被激活［34］。同樣，蘿卜防御素RsAFP2和苜蓿防御素Ms Def1也會(huì)牽連真菌禾谷鐮刀菌發(fā)揮MAPK通路，從而保護(hù)病原體細(xì)胞壁的完整性［35］（圖 3-B）。

圖3 植物防御素抗真菌機(jī)制和真菌耐受機(jī)制［36］

3 外源表達(dá)植物防御素的研究進(jìn)展

目前真菌病原菌侵染的植物物種逐漸威脅人類健康和破壞生物多樣性。受感染的主要是小麥、大豆、玉米和香蕉，導(dǎo)致了作物的產(chǎn)量下降，影響人們生活。因此，提高糧食安全和保護(hù)生物多樣性成為我們追求的目標(biāo)。在過去十幾年中，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因超表達(dá)的防御素在幾種植物中明顯增加了對(duì)真菌疾病的抗性，這也表明它們?cè)谥参镏芯哂锌拐婢臐摿Α谋?中可看出大多數(shù)研究是基于植物防御異源表達(dá)研究其對(duì)病菌的抑制作用。

表2 外源表達(dá)植物防御素的概述

4 結(jié)語

植物防御素廣泛的生物學(xué)功能具有無限的應(yīng)用潛力，也必將對(duì)植物研究、生產(chǎn)、加工等諸多行業(yè)產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。隨著對(duì)于植物防御素的研究的逐步加深、生物技術(shù)的不斷進(jìn)步以及生物產(chǎn)業(yè)的深化與改進(jìn)，植物防御素的價(jià)值將會(huì)越來越多的展現(xiàn)。

［1］Zeya HI, Spitznagel JK. Cationic proteins of polymorphonuclear leukocyte lysosomes I. Resolution of antibacterial and enzymatic activities［J］. Bacteriol, 1996, 91：750-754.

［2］Robert L, GanT, Selsted ME, et al. Defensins natural peptide antibiotics of human neutrophils［J］. J Clin Invest, 1985, 76 ：1427-1435.

［3］Hoffmann J, Keppi E, Dimarcq JL, et al. Insecimmunity isolation from immune blood of the dipteran phormiaterranovae of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lungmacrophage bacterial peptides［J］. Proc Natl Acad Sci, 1989,86（1）：262-266.

［4］Mendez E, Moreno A, Colilla F, et al. Primary structure and inhibition of protein synthesis in eukaryotic cell-free system of a novel thionin, gamma-hordothionin, from barley endosperm［J］.Biochemistry, 1990, 194（2）：533-539.

［5］Terras FR, Schoofs HM, De Bolle MF, et al. Analysis of two novel classes of antifungal proteins from radish（Raphanus sativus L.）seeds［J］. Biological Chemistry, 1992, 267（22）：15301-15309.

［6］宰文珊, 葉曙光, 苗立祥, 等. 番茄全基因組防御素基因鑒定及表達(dá)分析［J］. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2015, 23（12）：1588-1596.

［7］蔣明, 張志仙, 錢寶英, 等. 結(jié)球白菜和擬南芥防御素基因的鑒定與比較分析［J］. 植物病理學(xué)報(bào), 2013, 43（4）：368-375.

［8］劉勸, 陶永輝, 白瑞珍, 等. 白色蕓豆防御素的促凋亡作用和抑制肺癌細(xì)胞株A549增殖效應(yīng)［J］. 江蘇醫(yī)藥, 2014, 40（8）：884-885.

［9］高天姝, 鄭小敏, 郭楠, 等. 甘藍(lán)型油菜防御素基因的克隆與表達(dá)分析［J］. 作物學(xué)報(bào), 2015, 41（5）：725-732.

［10］Bruix M, Jimenez MA, Santoro J, et al. Solution structure of gamma1-H and gamma1-P thionins from barley and wheat endosperm determined by 1H-NMR：a structural motif common to toxic arthropod proteins［J］. Biochemistry, 1993, 32（2）：715-724.

［11］林軍岳. Gcthionin及其突變體的表達(dá)、純化、抗真菌活性及作用機(jī)制研究［D］. 成都：電子科技大學(xué), 2013：1-43.

［12］］李鑫, 侯和勝. 植物防御素基因的測(cè)序和序列分析［J］. 植物生理學(xué)通訊, 2008, 44（2）：229-234.

［13］Segura A, Moreno M, Molina A, et al. Novel subfamily from spinach（Spinacia oleracea）［J］. Febs Letters, 1998, 435（2-3）：159-162.

［14］朱立成, 羅輝, 任悍. 植物防御素結(jié)構(gòu)與功能及其真菌機(jī)制研究進(jìn)展［J］. 生物技術(shù)通報(bào), 2014（3）：9-14.

［15］Candido EDS, Cardoso MHES, Sousa DA, et al. The use of versatile plant antimicrobial peptides in agribusiness and human health［J］. Peptides, 2014, 55（5）：65-78.

［16］Anayalopez JL, Lopezmeza JE, Baizabalaguirre VM, et al.Fungicidal and cytotoxic activity of a Capsicum Chinese defensin expressed by endothelial cells［J］. Biotechnology Letters, 2006,28（14）：1101-1108.

［17］Wang S, Rao P, Ye X. Isolation and biochemical characterization of a novel leguminous defence peptide with antifungal and antiproliferative potency［J］. Applied Microbiology and Biotechnology, 2009, 82（1）：79-86.

［18］Chen KC, Lin CY, Kuan CC, et al. A Novel defensin encoded by a mung bean cDNA exhibits insecticidal activity against bruchid［J］. Agric Food Chem, 2002, 51（25）：7258-7263.

［19］Wijaya R, neumann GM, Condron R, et al. Defense proteins from seed of Cassia fistula include a lipid transfer protein homologue and a protease inhibitory plant defensin［J］. Plant Science, 2000,159（2）：243-255.

［20］Kushmerick C, Castro MS, Cruz JS, et al. Functional and structural features of γ-zeathionins, a new class of sodium channel blockers［J］. Febs Letters, 1998, 440（3）：302-306.

［21］Mirouze M, Sels J, Richard O, et al. Putative novel role for plant defensins：adefensin from the zinc hyper-accumulating plant,Arabidopsis halleri, confers zinc tolerance［J］. Plant Journal,2006, 47（3）：329-342.

［22］DeBrucker K, Cammue BP, Thevissen K. Apoptosis inducing antifungal peptides and proteins［J］. Biochemical Society Transactions, 2011, 39（5）：1527-1532.

［23］ Wilmes M, Cammue BPA, Sahl HG, et al. Antibiotic activities of host defense peptides：more to it than lipid bilayer perturbation［J］. Natural. Product. Reports, 2011, 42（49）：1350-1358.

［24］ Thevissen K, Terras FR, Broekaert WF. Permeabilization of fungal membranes by plant defensins inhibits fungal growth［J］.Applied and Environment Microbiology, 1999, 65（12）：5451-5458.

［25］Nimrichter L, Rodrigues ML. Fungal glucosylceramides：from structural components to biologically active targets of new antimicrobials［J］. Frontiers in Microbiology, 2011, 2（1）：212.

［26］Thevissen K, Cammue BP, Lemaire K, et al. A gene encoding a sphingolipid biosynthesis enzyme determines the sensitivity of Saccharomyces cerevisiae to an antifungal plant defensin from dahlia（Dahlia merckii）［J］. Proc Natl Acad Sci, 2000, 97（17）：9531-9536.

［27］Thevissen K, Warnecke DC, Francois IE, et al. Defensins from insects and plants interact with fungal glucosylceramides［J］.Biological Chemistry, 2004, 279（6）：3900-3905.

［28］Ramamoorthy V, Cahoon EB, Li J, et al. Glucosylceramide synthase is essential for alfalfa defensin-mediated growth inhibition but not for pathogenicity of Fusarium graminearum［J］. Molecular Microbiology, 2007, 66（3）：771-786.

［29］Paula V, Razzera G, Medeiros L, et al. Evolutionary relationship between defensins in the poaceae family strengthened by the characterization of new sugarcane defensins［J］. Plant Molecular Biology, 2008, 68（4）：321-335.

［30］Medeiros LN, Angeli R, Sarzedas CG, et al. Backbone dynamics of the antifungal Psd1 pea defensin and its correlation with membrane interaction by NMR spectroscopy［J］. Biochimica Et Biophysica Acta, 2010, 1798（2）：105-113.

［31］Van NL, Lay FT, Anderson MA. The plant defensin, NaD1, enters the cytoplasm of Fusarium oxysporum hyphae［J］. Biological Chemistry, 2008, 283（21）：14445-14452.

［32］Aerts AM, Gutierrez DC, Lefevre S, et al. The antifungal plant defensin RsAFP2 from radish induces apoptosis in a metacaspase independent way in Candida albicans［J］. Febs Letters, 2009,583（15）：2513-2516.

［33］Aerts AM, Bammens L, Govaert G, et al. The antifungal plant defensin HsAFP1 from Heuchera sanguinea induces apoptosis in Candida albicans［J］. Frontiers in Microbiology, 2011, 2（47）：47.

［34］Martin H, Flandez M, Nombela C, et al. Protein phosphatases in MAPK signalling ：we keep learning from yeast［J］. Molecular Microbioogyl, 2005, 58（1）：6-16.

［35］Barbara DC, Bruno PA, Karin T. Modes of antifungal action and in planta functions of plant defensins and defensin-like peptides［J］. Fungal Biology Reviews, 2013, 26（4）：109-120.

［36］馬佳, 王猛, 陳捷, 哈茨木霉SH2303誘導(dǎo)玉米抗小斑病菌研究［C］中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)第十一次全國會(huì)員代表大會(huì)暨2013年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集. 北京：中國植物保護(hù)協(xié)會(huì), 2013.

［37］楊洋. 中間錦雞兒兩個(gè)逆境脅迫相關(guān)基因CiDef2和CiDHN3農(nóng)業(yè)大學(xué)的克隆及表達(dá)分析［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古大學(xué),2015：1-40.

［38］默輝娟, 王省芬, 張艷, 等. 棉花S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因參與擬南芥黃萎病抗性［C］. 全國棉花青年學(xué)術(shù)研討會(huì)論文匯編. 安陽：棉花學(xué)報(bào), 2015.

［39］Zakhar O. Shenkarev, Albina K. Heterologous expression and solution structure of defensing from lentil Lens culinaris［J］.Biochemical and Biophysical Research Communications, 2014, 24（7）：104-108.