胡月 陳航，2 楊巽喆 李慶 楊輝

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，成都 611130；2. 眉山職業(yè)技術(shù)學(xué)院，眉山 620000）

獼猴桃因其品質(zhì)鮮嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，被譽(yù)為“水果之王”。中國(guó)是獼猴桃屬植物的起源中心，栽培面積最大，主要分布于陜西、四川、河南、貴州等省，其中，四川主栽品種“紅陽(yáng)”，因其獨(dú)特的優(yōu)良紅色條紋性狀和優(yōu)異的風(fēng)味成為新一代的主流品種［1］。

然而，該品種易感獼猴桃潰瘍病，病菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv.actinidiae，PSA），該菌適應(yīng)性廣，致病力強(qiáng)，來(lái)勢(shì)兇猛，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)，整株枯死，幾年間造成果園毀滅［2-4］。該病害于1984 年日本靜岡縣首次發(fā)現(xiàn)，隨后在韓國(guó)、意大利、法國(guó)、葡萄牙、西班牙、新西蘭和智利等多個(gè)國(guó)家陸續(xù)報(bào)道［5-8］。目前中國(guó)陜西［9］和四川等多個(gè)省份的獼猴桃產(chǎn)區(qū)有潰瘍病爆發(fā)，四川蒼溪、雅安、都江堰等多個(gè)市縣的獼猴桃產(chǎn)區(qū)均有大規(guī)模潰瘍病發(fā)生，部分果園完全毀園，對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及經(jīng)濟(jì)損失造成嚴(yán)重影響。近些年，隨著獼猴桃潰瘍病感病品種的苗木繁育和調(diào)運(yùn)不規(guī)范，防治困難等因素的影響，使得獼猴桃潰瘍病的發(fā)生、傳播和蔓延面積進(jìn)一步擴(kuò)大，現(xiàn)已成為獼猴桃的毀滅性病害，是生產(chǎn)上亟待解決的重大問(wèn)題之一。

2010年后，隨著潰瘍病給獼猴桃產(chǎn)業(yè)帶來(lái)的嚴(yán)重?fù)p失，國(guó)內(nèi)外專家學(xué)者對(duì)獼猴桃潰瘍病的病原菌進(jìn)行了研究和分類。目前，將全球的PSA分成4類［10-12］：PSA1包括日本和1992年在意大利引起的獼猴桃潰瘍??；PSA2只存在于韓國(guó)，其他國(guó)家尚未發(fā)現(xiàn)這一類群；PSA3廣布于全球，包括中國(guó)、智力、新西蘭、意大利（2008-2009年發(fā)生的獼猴桃潰瘍病等）和韓國(guó)［13］；PSA4主要分布于新西蘭和澳大利亞。在各類群中，自從2008年意大利爆發(fā)了致病性極強(qiáng)的PSA3類群以來(lái)，該病害開始對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成重大影響，才逐漸受到人們的關(guān)注，PSA3已成為制約全球獼猴桃產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要致病類群。因此，田間帶菌果樹的早期檢測(cè)，是防治獼猴桃潰瘍病的關(guān)鍵；對(duì)調(diào)運(yùn)苗木的準(zhǔn)確診斷，是防治其蔓延的關(guān)鍵。建立一套高效、快速、方便、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，進(jìn)而有利于實(shí)現(xiàn)該病害的早期診斷和及時(shí)防治。

目前，主要通過(guò)PCR擴(kuò)增特異基因序列進(jìn)行PSA的分子檢測(cè)。2017年，Cimmino等［14］報(bào)道制備了一種PSA胞外多糖的多克隆抗體，建立了一種獼猴桃潰瘍病菌的血清學(xué)檢測(cè)。本研究則根據(jù)2013年McCann等［11］對(duì)獼猴桃潰瘍病菌不同類群基因組的分析，尤其是效應(yīng)子在PSA各類群中的差異比較，指出PSA3類群的特異效應(yīng)子包括Hopz5、NRPS、hopH1、hopAM-2和hopAA1-2。此外，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http://ncbi.nlm.nih.gov/）和 T3SE 數(shù)據(jù)庫(kù)（http:// pseudomonas-syringae.org/）提供的信息，表明僅Hopz5效應(yīng)子不存在于其他細(xì)菌中。因此，利用該效應(yīng)子進(jìn)行分子檢測(cè)，以及制備的抗體行血清學(xué)檢測(cè)都將表現(xiàn)高度的特異性及準(zhǔn)確性。目前，鑒于Ciarroni等［15］報(bào)道中國(guó)獼猴桃潰瘍病菌為PSA3類群，并且前期我們對(duì)四川各地獼猴桃潰瘍病菌類群的鑒定，也證實(shí)其為該類群。因此，本研究選擇PSA3特異效應(yīng)子Hopz5制備的多克隆抗體，通過(guò)對(duì)抗體特性分析，旨為提供一種用于PSA3血清學(xué)檢測(cè)用試劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 獼猴桃品種為紅陽(yáng)；獼猴桃潰瘍病菌分離自蒼溪獼猴桃發(fā)病果園，并于實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆?；田間各檢測(cè)用樣品材料取自都江堰。

1.1.2 供試試劑及儀器 Hopz5多克隆抗體由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供；限制性內(nèi)切酶Xho I、BamH I，Primestar HS polymerase購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自Tiangen 公司；預(yù)染蛋白marker，HRP（辣根過(guò)氧化物酶），卡那霉素購(gòu)自北京全式金公司。TMB顯色液購(gòu)自天根公司。堿性磷酸酶購(gòu)自中杉金橋公司。NBT/BCIP試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)公司。引物由蘇州金唯智公司合成。UVP 凝膠成像儀為美國(guó)BIO-RAD，DNA濃度檢測(cè)儀為美國(guó)Thermo公司的NANODROP200。

1.2 方法

1.2.1 不同類型樣品的制備 PSA在LB固體培養(yǎng)基上進(jìn)行畫線，放于25℃ 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，將菌落用無(wú)菌水洗脫，制備為1×108CFU/mL的PSA菌懸液。感病組織總蛋白提取過(guò)程：液氮充分研磨材料，按照1 g∶2 mL，加入蛋白提取緩沖液（50 mmol/L Tris.HCl（PH 6.8），4% SDS，6%β-巰 基 乙 醇，4mol/L尿素，10%甘油）。100℃溫浴10 min，然后12 000×g離心10 min，取上清即為總蛋白。組織浸泡液制備過(guò)程：將帶菌組織切成小碎塊，0.005 g樣品碎片中加入無(wú)菌水20 μL，浸泡10 s，吸取浸泡液備用。以制備的PSA菌懸液，感病組織提取的總蛋白和組織浸泡液這3種樣品為材料，用于ELISA檢測(cè)。

1.2.2 ELISA檢測(cè) ELISA的操作步驟參照以前報(bào)道的方法略有改動(dòng)［16］。取待測(cè)樣品，平均每孔加入樣品10 μL、包被液90 μL，置于37℃充分吸附2 h；倒出固定液，平均各孔加入220 μL PBST，洗板3次后每孔加入100 μL封閉液，置于37℃溫育2 h；倒出封閉液，用PBST洗板3次后每孔加入100 μL用PBST稀釋成1∶2 000的一抗（PAb-Hopz5），37℃孵育2 h；倒出一抗，用PBST洗板3次后每孔加入100 μL用 PBS將辣根酶結(jié)合的山羊抗小鼠的IgG（二抗）（1∶2 000），37℃培養(yǎng)90 min；倒出二抗，用PBST洗板3次后每孔加入100 μL底物緩沖液，于空白對(duì)照開始顯色時(shí)，每孔加入2 mol/L H2SO4100 μL終止反應(yīng)，待藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm下的OD值。

1.2.3 不同侵染時(shí)期的蛋白表達(dá)檢測(cè) 取兩年生的獼猴桃枝干約20 cm，先用無(wú)菌水沖洗，再用1%次氯酸鈉浸泡 10 min進(jìn)行表面消毒，然后用無(wú)菌水浸泡漂洗3次，每次 10 min。PSA于25℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（16-18 h），收集菌體細(xì)胞（5 000 r/min，10 min），并重懸浮在1×PBS緩沖液中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法調(diào)節(jié)菌懸液濃度至 1×108CFU/mL。于接種后3、6、12和24 d取材，提取總蛋白，取10 μL用于ELISA檢測(cè)。

1.2.4 Hopz5抗體的特異性檢測(cè) 將丁香假單胞菌番茄致病變種、枯草芽孢桿菌、姜瘟菌、巨大芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌、大黃歐文氏菌培養(yǎng)24 h后用包被液制成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液，取50 μL用于ELISA檢測(cè)。

1.2.5 Hopz5抗體的ELISA靈敏度檢測(cè) 將PSA制備為1×108CFU/mL的菌懸液，用無(wú)菌水梯度稀釋 為 107、106、105、104、103、103、102、101、100CFU/mL和無(wú)菌水做對(duì)照，每個(gè)稀釋梯度取10 μL用于ELISA檢測(cè)；10 μL用于PCR檢測(cè)。

1.2.6 Hopz5抗體的田間樣品檢測(cè) 從都江堰獼猴桃潰瘍病發(fā)病果園，隨機(jī)取30個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品分成兩份，一份提取DNA，用于PCR檢測(cè)，所用引物為PSAF1：5'-TTTTGCTTTGC ACACCCGATTTT-3'和 PSAR2：5'-CACGCACCCTT CAATCAGGATG-3'［17］，擴(kuò)增大小 280 bp ；Hopz5-F ：5'-TCACTCCTAGACTGGAATAC-3'和Hopz5-R：5'-GGCTATCATGAAGGCTGTCA-3'，擴(kuò)增大小550 bp。另一份提取植物總蛋白，用于ELISA檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 Hopz5抗體的Western-blot檢測(cè)

將PSA3特異效應(yīng)子Hopz5多克隆抗體首先通過(guò)Western-blot進(jìn)行檢測(cè)，其檢出的信號(hào)條帶為38.98 kD，與預(yù)期大小一致，且檢測(cè)條帶單一（圖1），進(jìn)而將Hopz5抗體進(jìn)行后續(xù)特性分析。

圖1 PAbs-Hopz5的Western blot檢測(cè)

2.2 Hopz5抗體對(duì)不同類型樣品的檢測(cè)分析

Hopz5是獼猴桃潰瘍病菌的一個(gè)特異效應(yīng)子，是病原細(xì)菌在侵染寄主過(guò)程中的重要致病因子之一。Hopz5多克隆抗體能否用于檢測(cè)培養(yǎng)的PSA，有待驗(yàn)證。因此，將培養(yǎng)24 h的PSA菌液，以感病獼猴桃組織的總蛋白和感病組織浸泡液為參照，ELISA檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明3種樣品均能顯色，其中菌懸液、蛋白樣品和組織浸泡液的OD450值分別為1.74、1.66和1.32，P/N值均大于2，結(jié)果為陽(yáng)性，表明Hopz5抗體對(duì)培養(yǎng)基上的PSA同帶菌獼猴桃組織一樣，可進(jìn)行檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用范圍。

2.3 不同侵染時(shí)期的蛋白表達(dá)分析

為了明確Hopz5抗體檢測(cè)是否受PSA不同侵染時(shí)期的影響，我們將人工接種PSA的枝干，于接種后3、6、12和24 d，提取總蛋白，進(jìn)行ELISA檢測(cè)，OD450值分別為1.46、1.74、1.75和1.76，P/N值均大于2，結(jié)果如圖3，表明該抗體可以穩(wěn)定檢測(cè)PSA不同侵染時(shí)期的材料。

圖2 不同類型的PSA樣品檢測(cè)

圖3 不同接種時(shí)期的PSA檢測(cè)

2.4 Hopz5抗體的特異性分析

將PSA和其他7種供試細(xì)菌進(jìn)行特異性分析，PSA菌懸液發(fā)生明顯反應(yīng)，OD450值為1.71，P/N值大于2。與供試菌枯草芽孢桿菌、姜瘟菌、丁香假單胞菌番茄致病變種、巨大芽孢桿菌、惡臭假單胞菌、熒光假單胞菌和大黃歐文氏菌無(wú)交叉反應(yīng)，OD450值均約0.2，結(jié)果如圖4，表明Hopz5抗體對(duì)PSA的檢測(cè)特異性較好。

2.5 Hopz5抗體的ELISA檢測(cè)靈敏度分析

為了明確Hopz5多克隆抗體檢測(cè)PSA的有效靈敏度，采用ELISA和PCR兩種方法對(duì)比分析。將PSA菌懸液稀釋成3×100-3×108CFU/mL 9個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度梯度分別用于PCR和ELISA檢測(cè)。結(jié)果顯示（圖5），Hopz5抗體用于ELISA檢測(cè)的最低菌懸液濃度為3× 105CFU/mL，受靈敏度限制，利用該抗體可進(jìn)行帶菌苗木和田間樣品的診斷。然而，PCR檢測(cè)PSA菌懸液的最低濃度為3×10 CFU/mL，具有較高的檢測(cè)靈敏度。

圖4 PAb-Hopz5的特異性檢測(cè)

圖5 ELISA分析PAb-Hopz5的檢測(cè)靈敏度

2.6 Hopz5抗體的田間樣品檢測(cè)

為了明確Hopz5多克隆抗體的檢測(cè)準(zhǔn)確性，我們以田間獼猴桃潰瘍病發(fā)病樣品為材料，結(jié)合PCR結(jié)果對(duì)比分析。將采集的田間樣品一份提取DNA，用于PCR檢測(cè)；另一份提取總蛋白，用于ELISA檢測(cè)。ELISA檢測(cè)樣品編號(hào)為3-19的OD450值大于1.5，P/N值大于2（圖6），均為陽(yáng)性結(jié)果，與PCR檢測(cè)一致。然而，即使PCR檢測(cè)菌懸液的靈敏度較高，但對(duì)于大部分田間樣品材料，PCR擴(kuò)增的目標(biāo)條帶并不夠清晰，推測(cè)由于獼猴桃多糖多酚類物質(zhì)含量高，影響核酸提取質(zhì)量，進(jìn)而對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物造成影響。然而，田間樣品的ELISA檢測(cè)結(jié)果明顯，其可信度高，說(shuō)明Hopz5可用于ELSIA的田間樣品診斷。

圖6 PAb-Hopz5的田間樣品檢測(cè)

3 討論

近些年，獼猴桃潰瘍病對(duì)獼猴桃產(chǎn)業(yè)具有毀滅性的破環(huán)，造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，對(duì)病原菌的檢測(cè)為限制其進(jìn)一步擴(kuò)展和及時(shí)防治提供依據(jù)。

目前，分子檢測(cè)是獼猴桃潰瘍病菌的主要方式。在全基因組未測(cè)序之前，2002年Koh等［18］通過(guò)SRAP分析，篩選了一段能夠擴(kuò)增PSA的序列，建立了獼猴桃潰瘍病菌的分子檢測(cè)方式。2010年Rees-George等［17］根據(jù) PSA的 16S-23SrDNA的 ITS區(qū)域，設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，但該引物不能將P. syringae pv. theae區(qū)分。2013年Balestra等［19］建立的PSA雙重PCR檢測(cè)體系，其中利用HopZ3序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，能夠特異檢測(cè)PSA，并將P. syringae pv. theae區(qū)分。雖然，血清學(xué)檢測(cè)具有操作方便的特點(diǎn)，針對(duì)PSA卻發(fā)展較慢，直到2017年，Cimmino等［14］制備了一種PSA胞外多糖的多克隆抗體，才建立了獼猴桃潰瘍病菌的ELISA檢測(cè)。本研究則基于PSA的主要致病類群PSA3，選擇特異性效應(yīng)子Hopz5，制備了相應(yīng)的多克隆抗體，建立了一種針對(duì)我國(guó)主要類群的血清學(xué)檢測(cè)方法。

效應(yīng)子、胞外多糖、胞外酶和毒素等通常為病原菌的致病因子。效應(yīng)子作為病原細(xì)菌的重要致病因子之一，能夠通過(guò)III型分泌系統(tǒng)進(jìn)入寄主植物中。例如，假單胞菌屬的hopW1效應(yīng)子能夠與感病寄主的機(jī)動(dòng)蛋白結(jié)合，破壞寄主正常生長(zhǎng)［20］。然而，Hopz5效應(yīng)子多克隆抗體能否廣泛用于PSA的檢測(cè)仍有待驗(yàn)證，畢竟目前鮮有利用效應(yīng)子進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究在抗體特性分析中，首先利用培養(yǎng)基上培養(yǎng)的PSA3和不同類型的材料進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Hopz5多克隆抗體均能檢測(cè)PSA3，但發(fā)病枝干浸泡液的檢測(cè)效果較人工培養(yǎng)的菌液和提取的總蛋白效果差，表明選用獼猴桃組織的蛋白進(jìn)行檢測(cè)是較好的一種樣品類型。此外，通過(guò)人工接種方式，對(duì)不同接種時(shí)期的樣品進(jìn)行檢測(cè)，均能檢出PSA3，說(shuō)明該抗體的檢測(cè)不受侵染時(shí)期的影響。通過(guò)特異性比較，Hopz5多克隆抗體對(duì)供試菌無(wú)交叉反應(yīng)。在靈敏度分析中，ELISA檢測(cè)PSA3菌懸液的最低濃度為3×105CFU/mL，與PCR的檢測(cè)靈敏度相比，差異較大，PCR能夠檢測(cè)PSA3的最低濃度為3×10 CFU/mL。然而，田間帶菌組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ELISA對(duì)樣品的檢測(cè)效果優(yōu)于PCR。推測(cè)原因在于，獼猴桃組織富含多糖多酚類物質(zhì)，對(duì)核酸提取質(zhì)量影響較大，進(jìn)而影響PCR的檢測(cè)結(jié)果。Hopz5抗體對(duì)田間樣品的檢測(cè)表明其結(jié)果較準(zhǔn)確，可信度較高。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)Hopz5抗體的特性分析和田間樣品檢測(cè)結(jié)果表明，我國(guó)由丁香假單胞菌獼猴桃致病變種PSA3類群引起的獼猴桃潰瘍病可以利用其效應(yīng)子Hopz5制備的多克隆抗體進(jìn)行血清學(xué)檢測(cè)，該抗體可運(yùn)用于室內(nèi)培養(yǎng)的菌液和田間樣品的檢測(cè)，可作為其他血清學(xué)檢測(cè)的試劑，具有較廣的應(yīng)用范圍。

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