郭紅艷 高涵 吳琦 孫曉杰 劉秀財(cái) 趙立群

（1. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，齊齊哈爾 161006；2. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床生化教研室，齊齊哈爾 161006；3. 齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像CT室，齊齊哈爾 161041）

血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶3（serumand glucocorticoid regulated protein kinase 3，SGK3）是PI3K信號(hào)通路中的下游分子，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該激酶可誘導(dǎo)腫瘤血管生成，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，是某些腫瘤分子診斷、治療的潛在靶點(diǎn)［1-2］。SGK3可促進(jìn)黑色素瘤、前列腺癌細(xì)胞增殖，靶向抑制SGK3可降低GBM細(xì)胞的增殖活性，SGK3的異位表達(dá)增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞侵襲性遷移，相反，SGK3 shRNA則減弱腫瘤細(xì)胞遷移［3-4，9］，而本課題組前期研究顯示，SGK3在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織，且與ER等臨床病理特征相關(guān)，過表達(dá)SGK3可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖，抑制其凋亡和侵襲轉(zhuǎn)移［5-6］。本研究在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建SGK3基因RNAi慢病毒載體，并進(jìn)一步在細(xì)胞水平觀察SGK3基因沉默對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MB-474增殖等生物學(xué)行為的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

MB-474細(xì)胞、293T 細(xì)胞購(gòu)自上海中科院細(xì)胞庫(kù)，重組穿梭質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒 pGag/Pol、pRev、pVSV-G、RNAi-Mate 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海吉瑪構(gòu)建 制 備，SYBR Premix Ex TaqTM、Prime Script TM RT reagent Kit購(gòu)自TaKaRa 公司，胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板為Nunc公司產(chǎn)品，胎牛血清購(gòu)自Gibco 公司，GAPDH、SGK3引物由上海生工公司合成，辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購(gòu)自SANTA CRUZ公司，GAPDH、SGK3 antibody購(gòu)自Proteintech公司、蛋白抽提、定量試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京嘉美生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建及包裝 從 GenBank查找SGK3基因序列（NM_001033578.2），設(shè)計(jì)4條針對(duì)人SGK3基因的特異性 shRNA 序列（表1），以通用序列（Negative control，NC）作為陰性對(duì)照，由蘇州吉瑪基因股份有限公司構(gòu)建，靶向SGK3基因的shRNA慢病毒表達(dá)載體，菌落PCR篩選重組陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序鑒定；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞 4×106接種于15 cm培養(yǎng)皿中，含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，37℃、5% CO2培養(yǎng)過夜，棄去培養(yǎng)液，將pGC-LV-GFP-SGK3和包裝質(zhì)粒pGag/Pol、pRev、pVSV-GD及無(wú)血清DMEM混勻后，RNAi-Mate介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，37℃溫育6 h后更換為含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞上清液，4℃，4 000 r/min，離心4 min，0.45 μm 過濾器過濾上清，與 4℃，20 000 r/min，離心2 h后收集、分裝病毒液，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

表 1 針對(duì)SGK3 基因的4 個(gè) siRNA 靶序列

1.2.2 病毒滴度測(cè)定 293T細(xì)胞以1×104細(xì)胞/ 孔接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后棄去培養(yǎng)基，將慢病毒原液用DMEM培養(yǎng)液10倍稀釋4個(gè)梯度，每個(gè)稀釋度3個(gè)復(fù)孔，在孔板中加入100 μL 慢病毒稀釋液培養(yǎng)24 h，更換為DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h，熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，并計(jì)算病毒原液滴度：病毒滴度（TU/mL）= 熒光細(xì)胞個(gè)數(shù)×1 000/每病毒原液量（μL）。

1.2.3 Real-time PCR檢測(cè)MB-474細(xì)胞SGK3 mRNA表達(dá) 收集各組慢病毒轉(zhuǎn)染和對(duì)照組細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄，以GAPDH為內(nèi)參照，定量分析SGK3基因mRNA表達(dá)（按說明書操作），SGK3引物序列為：上游5'-GATCCGGCGCCTTCCC-3'，下游5'-CCATCATGCAACCTGGCCC-3'；GAPDH引物序列為：上游5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'，下游：5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，共40個(gè)循環(huán)，計(jì)算2-△△Ct值比較各目的基因初始模板量差別。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)MB-474細(xì)胞SGK3蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞總蛋白提取及含量測(cè)定，取40 μg總蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)NC膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，分別用SGK3抗體（1∶1 000）、GAPDH 抗體（1∶2 000），4℃孵育過夜，辣根酶標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫孵育1.5 h，TBST洗膜后ECL顯色成像后，凝膠成像分析系統(tǒng)掃描分析蛋白條帶，以SGK3與GAPDH條帶積分光密度比值表示蛋白表達(dá)。

1.2.5 MTT方法檢測(cè)SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖的影響 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MB-474細(xì)胞、474-LV3-VC細(xì)胞和PGC-LV3-SGK3-1組細(xì)胞，按1×103細(xì)胞/孔接種于96 孔培養(yǎng)板，每組設(shè)4 個(gè)平行孔，于37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)，每天取出一塊培養(yǎng)板，加MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后棄培養(yǎng)液，加150 μL DMSO，震蕩15 min 后用酶標(biāo)儀在570 nm測(cè)定吸光度值，做細(xì)胞增長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞的增殖情況。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后 0.25%胰酶消化處理各組培養(yǎng)細(xì)胞，1 000 r/min離心10 min收集細(xì)胞，用冰預(yù)冷的PBS洗兩次，PI染色30 min后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，以標(biāo)準(zhǔn)程序用FACS（Becton-DickinsonUSA）檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光，資料經(jīng)ModFitL T 軟件分析。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x-±s表示；多組間資料相互比較進(jìn)行方差分析，LSD檢驗(yàn)，結(jié)果以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組慢病毒載體的測(cè)序鑒定

將4組構(gòu)建的表達(dá)載體的陽(yáng)性克隆行DNA測(cè)序，測(cè)序結(jié)果如圖1所示與設(shè)計(jì)的shRNA核苷酸序列完全一致，說明已成功構(gòu)建針對(duì)SGK3基因的重組慢病毒載體pGC-LV3-GFP-SGK3。

2.2 病毒滴度測(cè)定

各組慢病毒載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h后，熒光顯微鏡均可見較強(qiáng)綠色熒光（圖2），將病毒原液梯度稀釋并感染293T細(xì)胞后，計(jì)數(shù)各孔中表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，最終測(cè)得 pGC-LV-GFP-SGK3-1、2、3、4 病毒原液滴度值分別為 4×108、3×108、4×108和8×108TU/mL，提示病毒包裝成功。

2.3 轉(zhuǎn)染后SGK3 mRNA 水平的變化

Real-time PCR檢測(cè)MB-474細(xì)胞轉(zhuǎn)染外源基因SGK3特異性shRNA后，474-LV3-VC對(duì)照組SGK3 mRNA 表達(dá)抑制率為0.943 8±0.092 7。與其相比，PGC-LV3-SGK3-1、2、3、4實(shí)驗(yàn)組的 SGK3 mRNA表達(dá)水平均有不同程度降低，各組SGK3 mRNA的抑制率分別為0.233 0±0.072 9、0.307 2±0.072 1、0.514 9±0.035 7 和 0.597 2±0.096， 其 中 PGCLV3-SGK3-1在mRNA 表達(dá)水平抑制效果最為顯著（#△P＜0.01）（圖 3）。

圖1 pGC-LV3-GFP-SGK3測(cè)序結(jié)果

圖2 將重組病毒載體轉(zhuǎn)染后293T細(xì)胞后熒光顯微鏡下觀察GFP（40×）

2.4 慢病毒轉(zhuǎn)染后下調(diào)SGK3的蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果（圖4-A）表明，與MB-474細(xì)胞和474-LV3-VC組相比，其他各組細(xì)胞SGK3蛋白表達(dá)量雖均有不同程度降低，但其中PGCLV3-SGK3-1蛋白表達(dá)水平抑制具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（△P＜0.01）（圖 4-B）。

圖3 轉(zhuǎn)染慢病毒后各組細(xì)胞SGK3 mRNA水平

圖4 染慢病毒后各組細(xì)胞SGK3蛋白的達(dá)

2.5 SGK3基因沉默抑制細(xì)胞增殖

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，MB-474細(xì)胞和474-LV3-VC細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度無(wú)明顯差異（P＞0.05），而 PGC-LV3-SGK3-1細(xì)胞在接種 3 d后生長(zhǎng)增殖較前二者速度明顯減慢（P＜0.01），各組細(xì)胞倍增時(shí)間分別為（36.752 3±2.880 05）h、（35.278 9±5.629 52）h 和（44.490 7±9.328 99）h。

圖5 各組MB-474細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.6 SGK3基因沉默對(duì)細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果（圖6）顯示：MB-474細(xì)胞和474-LV3-VC和PGC-LV3-SGK3-1組細(xì)胞的G1期比例分別為（71.867±7.882）%、（61.203±9.623）%、（55.617±10.171）% ；G2期 比 例 分 別 為（8.5167±1.580）%、（9.283±0.799）%、（11.253±4.197）%；S期所占比列為（19.6133±10.171）%、（26.5133±3.904）%、（33.220±6.570）%；細(xì)胞凋亡比例為（9.807±2.072）%、（10.613±2.905）%、（15.767±1.185）%，即各組細(xì)胞在細(xì)胞周期G1、G2、S期的比例大致相近，無(wú)明顯差異（P＞0.05）；PGC-LV3-SGK3-1細(xì)胞細(xì)胞凋亡比例卻增加（*▲P＜0.05）。

3 討論

1999年SGK3作為SGK家族的新成員被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，學(xué)者們對(duì)該激酶的功能、與人類疾病及腫瘤的相關(guān)性等進(jìn)行了積極的研究和探索［7-9］，有觀點(diǎn)認(rèn)為，SGK3可以作為某些腫瘤治療的靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物［10］，近年來(lái)，有關(guān)SGK3與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系也逐漸引起重視。有報(bào)道指出，SGK3與乳腺癌雌激素（ER）受體表達(dá)相關(guān)、具有介導(dǎo)乳腺癌中INPP4B依賴性PI3K信號(hào)傳導(dǎo)的功能［4，11］。本課題組近年來(lái)研究結(jié)果顯示，SGK3在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)較正常乳腺組織增高，SGK3過表達(dá)會(huì)影響乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲遷移等惡性生物學(xué)行為［12］，而SGK3基因沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞的生物學(xué)行為是否也會(huì)產(chǎn)生影響，本實(shí)驗(yàn)研究構(gòu)建SGK3基因RNAi慢病毒載體，沉默MB-474乳腺癌細(xì)胞SGK3基因表達(dá)。結(jié)果表明SGK3基因沉默可抑制MB-474細(xì)胞增殖，延長(zhǎng)其倍增時(shí)間雖然對(duì)MB-474細(xì)胞周期無(wú)明顯影像（P＞0.05），但可促進(jìn)其凋亡（P＜0.05），提示SGK3 基因沉默能有效抑制乳腺癌的部分惡性生物學(xué)行為。

圖6 SGK3基因沉默對(duì)乳腺癌MB-474細(xì)胞周期的影

值得一提的是，雖然Akt在乳腺癌的作用已被廣泛研究，但SGK3作為PI3K下游的獨(dú)立信號(hào)分子［13-14］，其在乳腺癌中的作用發(fā)揮的作用和機(jī)制目前仍不清楚，研究者們也在力求從多角度闡述SGK3與乳腺癌的關(guān)系及其作用機(jī)制［8，15］。本課題前期研究結(jié)果表明，SGK3過表達(dá)會(huì)影響乳腺癌細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，同時(shí)對(duì)PI3K/AKT細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的某些關(guān)鍵因子如GSK3β等的表達(dá)產(chǎn)生影響，SGK3 基因沉默是否會(huì)乳腺癌細(xì)胞凋亡、侵襲相關(guān)基因的表達(dá)，其抑制乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制如何，需要在后續(xù)研究工作中進(jìn)一步探討和研究。此外，SGK3與乳腺癌TNM分級(jí)、AR、Ki67等影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后的臨床病理特征是否相關(guān)；是否可以作為乳腺癌治療的靶點(diǎn)及預(yù)后標(biāo)志物等問題將是今后的研究方向。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建靶向人SGK3基因的RNAi慢病毒載體，篩選出高效干擾MB-474細(xì)胞SGK3基因表達(dá)的有效靶點(diǎn)，初步證實(shí)SGK3基因沉默可對(duì)乳腺癌細(xì)胞周期無(wú)明顯影響，但可抑制其增殖，促進(jìn)其凋亡。

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