于光明 崔宗巖 曹彥忠 李學(xué)民 賈光群 張進(jìn)杰 王憲 高發(fā)明

（1 燕山大學(xué)環(huán)境與化學(xué)工程學(xué)院，秦皇島 066004；2 秦皇島出入境檢驗(yàn)檢疫局，秦皇島 066004；3 秦皇島市衛(wèi)生學(xué)校，秦皇島 066000）

蜂產(chǎn)品是營養(yǎng)全面的天然保健品，它不僅有調(diào)節(jié)機(jī)體生理機(jī)能，提高免疫力，增強(qiáng)體質(zhì)等功能，還能作為中藥輔料治療和輔助治療多種頑疾，從而使人健康長壽。我國是世界第一養(yǎng)蜂大國，也是蜂蜜出口大國。然而，自加入WTO后，美國、日本和歐洲作為我國蜂產(chǎn)品的主要出口地區(qū)紛紛提出蜂產(chǎn)品中農(nóng)藥、獸藥和化學(xué)污染物殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，采取各種技術(shù)性貿(mào)易措施，致使我國蜂產(chǎn)品出口受到一定程度的限制[1]。

多環(huán)芳烴（PAHs）是指由兩個或兩個以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的化合物，廣泛分布于天然環(huán)境中，具有較強(qiáng)的致癌、致畸、致突變性。目前，大多數(shù)國家都將PAHs列為環(huán)境監(jiān)測的重要內(nèi)容之一[2]。蜂產(chǎn)品，包括蜂蜜和蜂花粉等，可以作為環(huán)境污染的指示標(biāo)志物[3，4]，環(huán)境介質(zhì)中的PAHs可以通過生物鏈或其他途徑遷移至蜂蜜中，產(chǎn)生一定的殘留和污染風(fēng)險，因而需要建立蜂蜜中多環(huán)芳烴化合物的檢測方法，對其含量和污染水平進(jìn)行監(jiān)控。目前國內(nèi)外關(guān)于測定大氣、土壤、水、食品等基質(zhì)中PAHs的方法較為成熟，主要包括氣相色譜-質(zhì)譜法[5-7]和液相色譜-熒光檢測法[8-10]等。國外研究表明，蜂蜜中含有一定量多環(huán)芳烴，以小分子非致癌多環(huán)芳烴為主[11]。國內(nèi)測定蜂產(chǎn)品中PAHs殘留分析的文獻(xiàn)相對較少，其中PAHs的污染水平也缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)支撐。

本文采用固相萃?。⊿PE）結(jié)合氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法，建立了蜂蜜中16種PAHs的分析方法，該方法具有操作簡便，靈敏度高，準(zhǔn)確可靠的優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和裝置

美國Thermo Fisher公司的TSQ 8000型氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，配備有TRACE 1310氣相色譜儀，Agilent DB-1701色譜柱（30 m×0.25 mm×0.25μm）；日本YAMATO公司SA300型振蕩器；美國Organomation公司的N-EVAPTM112型氮吹儀；日本島津公司生產(chǎn)的TXB622L電子天平；瑞士MettlerToledo公司的XP105分析天平；美國Millipore公司的Milo-Q高純水發(fā)生器；美國 Scientific Industries Vortex Genie 2多用途旋渦混合器。

1.2 試劑和材料

16種PAHs標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥96.0%，美國SUPELCO公司，詳見表1）；準(zhǔn)確稱取各標(biāo)準(zhǔn)品適量，用甲苯稀釋成單標(biāo)儲備液；準(zhǔn)確吸取適量各標(biāo)準(zhǔn)儲備液于10 ml容量瓶中，用甲苯定容至刻度制成工作液混標(biāo)，其中各PAHs濃度均為2.0 mg/l，置于冰箱4℃保存。16種PAHs同位素標(biāo)準(zhǔn)品（PAHs-D，純度均≥98.0%，美國ChemService公司），配制及保存同上，工作液中各PAHs-D濃度均為2.0 mg/l。

丙酮、正己烷、環(huán)己烷、乙酸乙酯、甲苯等試劑均為HPLC級，C18固相萃取柱（1 g/6 ml），均購自DIKMA公司；氯化鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠。彩色單道移液槍（2～20 μl，20～200 μl，100～1000 μl，德國Eppendorf有限公司）；津騰公司的0.45 μm濾膜；無水硫酸鈉，分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠（650℃干燥4 h后置于干燥器中備用）。所用其他試劑均為分析純及以上純度。所有玻璃容器在洗滌后用去離子水沖洗，再用超純水清洗后烘干備用。

1.3 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確稱取5.0 g（精確到0.01 g）蜂蜜樣品于80 ml具塞玻璃離心管中，加入PAHs-D內(nèi)標(biāo)50 μl。加入50 ml去離子水溶解，渦旋混勻之后，震蕩30 min?；靹蚝笊蠘又罜18固相萃取小柱上（預(yù)先用6 ml甲醇、6 ml去離子水活化），繼續(xù)加入20 ml去離子水淋洗，控制流速≤6 ml/min，之后將小柱抽干5 min，然后用10 ml二氯甲烷進(jìn)行洗脫，洗脫液緩慢吹氮?dú)鉂饪s至近干，正己烷定容至1.0 ml后進(jìn)GC-MS/MS檢測。

1.4 GC-MS/MS條件

氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度290℃，載氣為高純He（純度＞99.999%），流速為1.5 ml/min；進(jìn)樣量1 μl，不分流進(jìn)樣；程序升溫：50℃保持1 min，以 30℃/min升溫至140℃，然后以10℃/min升溫至220℃，接著以5℃/min升溫至290℃，保持5 min。

質(zhì)譜條件：E I源，溫度280℃；傳輸線溫度280℃；掃描方式為選擇離子反應(yīng)監(jiān)測模式（SRM）。16PAHs及內(nèi)標(biāo)的定量離子對、定性離子和碰撞能量等信息見表1。

圖1 16種PAHs總離子流圖

表1 16種化合物及對應(yīng)同位素內(nèi)標(biāo)的串聯(lián)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)條件

2 結(jié)果與討論

2.1 串聯(lián)質(zhì)譜條件優(yōu)化

在選定的實(shí)驗(yàn)條件下，首先通過全掃描方式（Full Scan，m/z 50-550）獲得16種多環(huán)芳烴的保留時間和一級質(zhì)譜圖，從其中選擇豐度較高和質(zhì)荷比較大的離子作為母離子；在不同碰撞能量下進(jìn)行二級質(zhì)譜掃描，從二級質(zhì)譜圖中選擇子離子及對應(yīng)碰撞能量，從而獲得特征離子對。

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

根據(jù)多環(huán)芳烴化合物的性質(zhì)，選擇C18固相萃取柱小柱對蜂蜜樣品中目標(biāo)物進(jìn)行富集和凈化，并選用二氯甲烷為洗脫溶劑，對其用量進(jìn)行考察。C18小柱活化后加入PAHs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μl，然后直接加入二氯甲烷進(jìn)行洗脫，每2 ml收集洗脫液，緩慢濃縮至近干，正己烷定容至1 ml，分別進(jìn)樣后繪制洗脫曲線見圖2?？梢姡褂? ml二氯甲烷，即可將16PAHs完全洗脫下來，實(shí)際樣品洗脫溶劑用量適當(dāng)放寬，選擇為10 ml。

進(jìn)一步選取某空白洋槐蜜樣品，向其中添加濃度為20 μg/kg的PAHs混標(biāo)，制成陽性樣品，并用其對體系pH值、改性劑用量和淋洗劑用量等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行考察。

樣品溶于水后將其pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0和7.0，按照上述步驟進(jìn)行SPE上樣、淋洗、洗脫、濃縮和檢測。結(jié)果表明，在測試范圍內(nèi)蜂蜜樣品pH對實(shí)驗(yàn)結(jié)果無明顯影響。由于大多數(shù)蜂蜜樣品 pH 值在 3.92～5.03 之間[12]，在考察范圍內(nèi)，對PAHs檢測無影響，因而實(shí)驗(yàn)選擇不進(jìn)行pH調(diào)節(jié)。

圖2 代表性多環(huán)芳烴在C18固相萃取柱上的洗脫

表2 16種PAHs的線性范圍、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)

表3 代表性蜂蜜樣品的16種PAHs的添加回收率和精密度

樣品溶于水后分別加入適量改性劑甲醇，含量分別為0、1%、2%、5%和10%，進(jìn)行SPE處理和檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明甲醇小于5%時，對PAHs檢測無明顯影響，而當(dāng)其含量增加至10%時，目標(biāo)物回收率略微降低，因而實(shí)驗(yàn)確定不加甲醇。

樣品溶于水后上樣進(jìn)行SPE富集，然后分別加入不同含量的去離子水進(jìn)行淋洗，加入量分別為0、5、10、20、30、50 ml，然后抽干、洗脫和檢測，結(jié)果表明，淋洗劑用量不超過30 ml時，目標(biāo)物響應(yīng)無明顯影響，但其含量達(dá)到50 ml時，目標(biāo)物響應(yīng)略有降低，因而實(shí)驗(yàn)選擇淋洗劑用量為30 ml。

表4 實(shí)際蜂蜜樣品的16種多環(huán)芳烴檢測結(jié)果，μg/kg

2.3 方法評價

2.3.1 線性及檢出限

取適量PAHs工作液混標(biāo)，加入內(nèi)標(biāo)50 μl，用正己烷稀釋配置成濃度為10、20、50、100、200、500的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（對應(yīng)樣品濃度為2.0～100 μg/kg），以目標(biāo)物與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，以目標(biāo)物濃度（X）為橫坐標(biāo)，繪制工作曲線，得到16種PAHs的線性范圍、線性回歸方程以及相關(guān)系數(shù)（表2）。結(jié)果表明，16種PAHs的線性相關(guān)系數(shù)（r2）均不低于0.995，表明線性關(guān)系良好。以3倍信噪比(3S/N)對應(yīng)濃度為方法檢出限，10倍信噪比(10S/N)對應(yīng)濃度為方法定量限，得到該方法對16種多環(huán)芳烴的檢出限為0.6 μg/kg，定量限為2.0 μg/kg。

2.3.2 回收率和精密度

選取棗花蜜、荊條花蜜、洋槐蜜、紫云英蜜和椴樹蜜為代表性樣品基質(zhì)，在2.0 μg/kg，4.0 μg/kg和20 μg/kg三個添加水平下，按照上述流程進(jìn)行處理和測定（n=3），得到回收率和精密度數(shù)據(jù)見表3。結(jié)果表明，16種PAHs平均回收率在63.4～122.1%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于16%，能夠滿足日常檢測的要求。

2.3.3 實(shí)際樣品檢測

應(yīng)用本文建立的方法對市售10批蜂蜜樣品進(jìn)行檢測，樣品類型包括棗花蜜、洋槐蜜、油菜蜜、椴樹蜜、荊條蜜、紫云英蜜等，其中7個蜂蜜樣品有檢出，檢出PAHs以萘、苊、菲等小分子多環(huán)芳烴為主，具體數(shù)據(jù)見表4。說明本文方法適用于各類型蜂蜜樣品中多環(huán)芳烴化合物檢測。

3 結(jié)論

建立了蜂蜜中16種多環(huán)芳烴化合物檢測的固相萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。方法檢出限達(dá)到0.6 μg/kg，回收率和精密度良好，方法操作簡便，適用于各類型蜂蜜中多環(huán)芳烴化合物的測定。

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