劉枝婷，楊文瓊

Gephyrin是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的抑制性突觸后蛋白網(wǎng)絡(luò)的骨架蛋白[1]，也是其核心骨架蛋白[2]，于1982年由Betz團(tuán)隊(duì)[3]首次在大鼠脊髓的甘氨酸受體（Glycine receptor，GlyR）中發(fā)現(xiàn)。Gephyrin主要參與組成中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）γ-氨基丁酸（gamma aminobutyric acid，GABA）、甘氨酸能抑制性突觸后蛋白網(wǎng)絡(luò)，并調(diào)節(jié)其突觸傳遞。Gephyrin在抑制性突觸中的功能類似于突觸后 致 密 蛋 白 95（postsynaptic density protein 95，PSD95）在興奮性突觸中的作用，PSD95主要存在于興奮性谷氨酸能突觸，為突觸后膜上受體活動(dòng)和穩(wěn)定性所必需，在突觸形成及突觸可塑性中起重要作用。而抑制性神經(jīng)傳遞，特別是GABA能神經(jīng)傳遞，參與調(diào)控神經(jīng)興奮性、認(rèn)知過程的形成等。Gephyrin結(jié)構(gòu)和功能異常會(huì)引起GABA能神經(jīng)回路的結(jié)構(gòu)和功能異常，從而導(dǎo)致多種神經(jīng)精神疾病的發(fā)生，如癲癇、阿爾茨海默病、精神分裂癥等。

1 Gephyrin的結(jié)構(gòu)及分布

Gephyrin是一種高度保守的蛋白，最初純化的Gephyrin是一個(gè)與GlyR有關(guān)的93 kDa的蛋白[4]，被認(rèn)為是GlyR的錨定蛋白。Gephyrin還具有連接細(xì)胞內(nèi)微管蛋白的特性，成為溝通GlyR和細(xì)胞骨架之間的橋梁[5]，其名稱橋尾蛋白即由此而得。

脊椎動(dòng)物中Gephyrin有三個(gè)主要功能區(qū)，分別是N末端的G區(qū)、C末端的E區(qū)和中間的C區(qū)。GephyrinE區(qū)對GlyR β亞基具有較高親和力。作為脊椎動(dòng)物中四種已知鉬酶之一的亞硫酸鹽氧化酶對生存是至關(guān)重要的，鉬輔因子在維持鉬酶活性中起關(guān)鍵作用，而保守的G區(qū)和E區(qū)共同參與鉬輔因子的合成[6]，GPHN（編碼Gephyrin）基因突變所導(dǎo)致的鉬輔因子缺乏是致命性的[7]。此外，E區(qū)二聚體和G區(qū)三聚體會(huì)促發(fā)Gephyrin多聚體形成，其形成后會(huì)固定在質(zhì)膜下，并形成抑制性突觸受體的錨。C區(qū)有很多氨基酸殘基，作為翻譯后修飾的位點(diǎn)，還可以連接其他突觸蛋白，如GABAA受體相關(guān)蛋白、動(dòng)力蛋白輕鏈1等。

在CNS，Gephyrin集簇選擇性分布于甘氨酸能、GABA能、混合型甘氨酸/GABA能突觸的突觸后位點(diǎn)。Lardi-Studler等[8]針對Gephyrin行免疫化學(xué)染色，在GABA能突觸后膜和甘氨酸能突觸后膜有0.4～10 μm2明亮的陽性染色點(diǎn)，這些染色點(diǎn)代表Gephyrin自我聚集，即所謂的“集簇”。運(yùn)用單分子成像方法對突觸后膜致密物質(zhì)（postsynapticdensity，PSD）中Gephyrin分子行定量分析示，Gephyrin集簇每平方微米由5 000～10 000個(gè)Gephyrin分子組成[9]。特異的神經(jīng)機(jī)制保證Gephyrin靶向作用于某些分子并在抑制性突觸后聚集，與Gephyrin相互作用的分子有不同的功能分類，Gephyrin與這些分子之間的相互關(guān)系目前尚未研究清楚。

2 Gephyrin的生物特性

2.1 Gephyrin與突觸后受體

Gephyrin參與組成CNS抑制性突觸后蛋白網(wǎng)絡(luò)，如 GABAA受體（GABAAreceptor，GABAAR）、GlyR。GABAAR和GlyR都屬于半胱氨酸環(huán)配體門控離子通道超家族的成員，兩者有較大的結(jié)構(gòu)同源性但也存在一些不同。

GlyR的亞基有5種（α1～α4、β），用針對GlyR α亞基的抗體行免疫組化染色示，GlyR在突觸后的分布正好覆蓋Gephyrin集簇在突觸后的分布。沉默Gephyrin的基因表達(dá)會(huì)阻礙GlyR在突觸后的聚集，提示Gephyrin對GlyR在突觸后聚集是必需的[10]。此外，將GlyR β亞基插入到其他跨膜蛋白會(huì)讓這些蛋白和Gephyrin產(chǎn)生聯(lián)系[11]，可見Gephyrin主要與GlyR β亞基相互作用。

GABAAR的亞基有19種，形態(tài)學(xué)分析示，只有部分亞基（α1、α2、α3、γ2）在突觸后與Gephyrin共定位，部分亞基（α4、α5、δ）不會(huì)與Gephyrin共定位。GABAAR α1、α2、α3亞基可以直接與Gephyrin發(fā)生相互作用。γ2亞基雖然不直接連接Gephyrin，但靶向敲除 Gabrg2（編碼 GABAAR γ2亞基）會(huì)阻礙Gephyrin和GABAAR在突觸后聚集[12]。但也有研究發(fā)現(xiàn)靶向敲除GPHN或其他亞基的基因后Gephyrin依賴性的GABAAR集聚仍然可以發(fā)生，提示GABAAR聚集對Gephyrin的需要由神經(jīng)和突觸類型而定。

值得注意的是，在GABA能突觸中Gephyrin在突觸后聚集需要依賴GABAAR。靶向敲除Gabra1（編碼GABAAR α1亞基）會(huì)阻礙大腦浦肯野細(xì)胞和丘腦中繼神經(jīng)元中Gephyrin聚集，但不影響突觸外含α4亞基的GABAAR的分布[13]。在缺乏突觸后GABAAR的突變神經(jīng)元中，盡管Gephyrin在細(xì)胞體和樹突也會(huì)形成大的集簇，但卻不能檢測到GABA能突觸電流[14]。靶向敲除Gabra3（編碼GABAAR α3亞基）的大鼠可以觀察到同樣的結(jié)果[15]。含有α3亞基的GABAAR在突觸后聚集需要α3亞基直接與Gephyrin發(fā)生相互作用。因此，Gephyrin在GABA能突觸后的聚集依賴于Gephyrin和GABAAR特定亞基間的相互作用。

2.2 Gephyrin與突觸形成

Um等[16]研究發(fā)現(xiàn)Gephyrin與IQSEC3蛋白相互作用促進(jìn)抑制性突觸形成，但Gephyrin在突觸形成初始階段的作用尚不明確。Neurexin和Neuroligin是分別位于突觸前膜和突觸后膜的跨膜蛋白，二者是突觸形成中最重要的粘聯(lián)蛋白。Pettem等[17]發(fā)現(xiàn)GephyrinMAM區(qū)域選擇性連接到Neuroligin2并干擾突觸活性。Neuroligin酪氨酸磷酸化會(huì)調(diào)節(jié)其與Gephyrin的相互作用。由此可見，Gephyrin可能通過Neuroligin2影響突觸形成。

Gephyrin磷酸化狀態(tài)可以在幾小時(shí)內(nèi)調(diào)節(jié)神經(jīng)元樹突上GABA能突觸的密度[18]，可見Gephyrin磷酸化狀態(tài)影響突觸形成。細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶5（cyclin dependent kinase 5，CDK5）促進(jìn)Gephyrin磷酸化及突觸后GABAAR聚集[19]。GABA突觸形成需要CB蛋白在胞膜錨定、PI3K-AKT信號(hào)通路激活，進(jìn)而抑制下游糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK3 β），最后使 Gephyrin270位絲氨酸磷酸化減少[18]。Gephyrin270位絲氨酸去磷酸化會(huì)引起Gephyrin構(gòu)象改變，這對活化突觸形成分子并與其發(fā)生相互作用至關(guān)重要[2]。Gephyrin與GABAAR相互作用也參與調(diào)節(jié)Gephyrin在GABA突觸形成中的作用。敲除CNS部分神經(jīng)元Gabrg2（編碼GABAAR γ2亞基）會(huì)引起突觸后GABAAR（包括PSD其他成分）聚集減少，而臨近未行Gabrg2敲除的神經(jīng)元GABAAR代償性增加[20]。由此可見，多種機(jī)制互補(bǔ)參與GABA突觸形成，保證PSD的發(fā)育和分化。

Kirsch等[21]模擬GlyR活化，膜去極化后通過L型鈣通道引起鈣離子內(nèi)流，隨后在質(zhì)膜下募集Gephyrin，Gephyrin集簇形成后會(huì)募集更多GlyR，這些GlyR反過來會(huì)增強(qiáng)Gephyrin穩(wěn)定性。Gephyrin可能在插入質(zhì)膜前已經(jīng)與GlyR結(jié)合，隨后通過微管共轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜。干擾原代脊髓神經(jīng)元微管穩(wěn)定性，會(huì)引起突觸后Gephyrin集簇減小，甘氨酸能最小抑制性突觸后電位的幅度和頻率也減小，而GABA能最小抑制性突觸后電位則沒有變化，提示Gephyrin與微管相互作用對于GlyR轉(zhuǎn)運(yùn)是必須的。用士的寧阻止GlyR形成，但不影響Gephyrin集簇形成，推測有突觸前膜因子參與調(diào)節(jié)突觸后Gephyrin聚集。

2.3 Gephyrin與突觸可塑性

Pennacchietti等[22]用超分辨技術(shù)發(fā)現(xiàn)，抑制性突觸傳遞的長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）中突觸上Gephyrin增加與突觸外Gephyrin分解有關(guān)，突觸上Gephyrin可以穩(wěn)定突觸后電位的幅度，提示除抑制性突觸受體數(shù)目外Gephyrin在PSD納米級(jí)別的重排也在抑制性突觸可塑性中起重要作用。Gephyrin可能作為一個(gè)信號(hào)中心，整合興奮性突觸活性及各種細(xì)胞外信號(hào)，改變GABA能神經(jīng)傳遞的強(qiáng)度，維持興奮/抑制神經(jīng)傳遞的平衡。細(xì)胞外信號(hào)可以在短時(shí)間內(nèi)調(diào)動(dòng)蛋白激酶和細(xì)胞內(nèi)鈣離子儲(chǔ)存，隨之Gephyrin構(gòu)象改變會(huì)影響其與信號(hào)分子的相互作用，引起GABA能PSD結(jié)構(gòu)和功能改變。

有研究證實(shí)GSK3β活性改變會(huì)作用于Gephyrin270位絲氨酸，通過改變GABA能神經(jīng)傳遞來調(diào)節(jié)樹突生長和分支[23]。Dejanovic等[24]發(fā)現(xiàn)DHHC蛋白家族中的DHHC-12蛋白引起的Gephyrin棕櫚?；梢栽鰪?qiáng)GABA能突觸傳遞，抑制DHHC-12蛋白后會(huì)造成Gephyrin集簇變小，推測DHHC-12蛋白通過影響Gephyrin聚集調(diào)節(jié)GABAAR活性，進(jìn)而增加抑制性突觸傳遞。重復(fù)磁刺激會(huì)引起突觸后Gephyrin集簇大小和數(shù)目降低、GABA能突觸傳遞強(qiáng)度降低[25]，推測GABA能突觸傳遞的改變由Gephyrin集簇改變引起。靶向敲除成人嗅球顆粒細(xì)胞前體Gabra2，會(huì)引起PSD中Gephyrin集簇減少、GABA突觸后電位的頻率和幅度降低，甚至改變樹突分支及樹突棘密度[26]，推測其形態(tài)改變可能與Gephyrin集簇減少有關(guān)。Dejanovic等[27]在培養(yǎng)的原代海馬神經(jīng)元中發(fā)現(xiàn)，一氧化氮合酶會(huì)促進(jìn)Gephyrin亞硝基化，并引起突觸后Gephyrin集簇變小，在GABA能突觸可塑性中發(fā)揮作用。

2.4 Gephyrin的翻譯后修飾

Gephyrin的翻譯后修飾通過影響C區(qū)或鄰近的G、E區(qū)的結(jié)構(gòu)引起構(gòu)象變化，從而改變Gephyrin聚集、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、連接特性，最終影響抑制性突觸功能。磷酸化是Gephyrin最常見的翻譯后修飾，多種信號(hào)分子參與調(diào)節(jié)Gephyrin磷酸化，CDK5通過CB蛋白促進(jìn)Gephyrin 270位絲氨酸磷酸化[2]，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1、2會(huì)使Gephyrin268位絲氨酸磷酸化[28]。對大鼠和小鼠的大腦進(jìn)行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)，Gephyrin有22個(gè)磷酸化位點(diǎn)，除了324位蘇氨酸分布在E區(qū)，其他分布在C區(qū)[29]。

除了磷酸化，Gephyrin還會(huì)發(fā)生棕櫚?；喯趸?、乙酰化、小泛素樣修飾物修飾等翻譯后修飾。Gephyrin作為棕櫚?；D(zhuǎn)移酶的底物，其212、284位半胱氨酸可發(fā)生棕櫚?；?。DHHC-12蛋白可以直接與Gephyrin相互作用，被認(rèn)為是引起Gephyrin棕櫚?；钪匾淖貦磅；D(zhuǎn)移酶[25]。此外，Gephyrin棕櫚?；赡軙?huì)間接影響Gephyrin磷酸化。Dejanovic等[27]發(fā)現(xiàn)一氧化碳合酶可促進(jìn)Gephyrin發(fā)生亞硝基化。Ghosh等[30]發(fā)現(xiàn)Gephyrin可以發(fā)生乙?；托》核貥有揎椢镄揎棧⒆C實(shí)Gephyrin磷酸化、乙酰化、小泛素樣修飾物修飾之間相互影響。

3 Gephyrin與神經(jīng)精神疾病

Gephyrin結(jié)構(gòu)和功能改變與多種神經(jīng)精神疾病有關(guān)，如癲癇[31]、缺血性腦卒中[32]、阿爾茨海默病[33]、鉬輔因子缺乏癥[9]、驚跳癥[34]、精神分裂癥[35]、自閉癥[36]、焦慮抑郁[37]等，但 Gephyrin 在這些疾病發(fā)病中的作用尚不明確。GPHN的mRNA傾向于廣泛的選擇性剪切，推測GPHN的mRNA選擇性剪切改變可能也參與上述疾病的發(fā)生。編碼Gephyrin、與Gephyrin相互作用分子基因的突變也必然會(huì)影響Gephyrin結(jié)構(gòu)和功能。推測不同致病因素?cái)_亂調(diào)節(jié)Gephyrin表達(dá)和聚集的信號(hào)通路，在重要時(shí)期干擾了GABA能、甘氨酸能神經(jīng)傳遞，導(dǎo)致Gephyrin異常相關(guān)神經(jīng)精神疾病的發(fā)生。

目前鋰劑（GSK3β抑制劑）已應(yīng)用于癲癇和雙相情感障礙的治療。鋰劑治療雙相情感障礙的研究發(fā)現(xiàn)，鋰劑可以在細(xì)胞水平和動(dòng)物模型水平通過抑制GSK3β有效增加Gephyrin集簇的密度和大小[18]。由此可見，進(jìn)一步明確Gephyrin在Gephyrin異常相關(guān)神經(jīng)精神疾病發(fā)病中的作用，有助于尋找針對性治療策略。

3.1 Gephyrin與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

F?rstera等[31]在顳葉癲癇患者中未檢測到Gephyrin基因序列異常，而是在細(xì)胞應(yīng)激（堿中毒、高熱等）時(shí)檢測到mRNA剪切過程中存在外顯子跳讀，形成缺失Gephyrin重要結(jié)構(gòu)的Gephyrin異常剪切變異體。在顳葉癲癇患者分離出4種Gephyrin G區(qū)異常剪切變異體，這些異常剪切變異體均影響Gephyrin正常聚集，間接影響GABAAR聚集，最終導(dǎo)致疾病發(fā)生。

糖氧剝奪模型中，細(xì)胞表面GABAAR表達(dá)下降，GABAAR各個(gè)亞基在蛋白水平和mRNA水平也是下降的。糖氧剝奪通過抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶使Gephyrin與GABAAR α1亞基相互作用關(guān)系減弱，隨后細(xì)胞表面的GABAAR會(huì)內(nèi)化，GABA能神經(jīng)傳遞減弱，擾亂興奮/抑制神經(jīng)傳遞的平衡，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[32]。

阿爾茲海默病是最常見的癡呆類型，臨床特征是認(rèn)知功能障礙[38]。Liang等[39]發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可降低β樣淀粉蛋白，并提高Gephyrin水平，進(jìn)而修復(fù)GABA能神經(jīng)傳遞及功能，最終改善阿爾茨海默病模型小鼠的行為缺陷及并逆轉(zhuǎn)其病理過程。反映臨床前期變化的1～3月齡APPPS1小鼠（阿爾茨海默病動(dòng)物模型）海馬CA1區(qū)和齒狀回的Gephyrin表達(dá)較對照組比較明顯增高，而反映臨床期變化的12月齡APPPS1小鼠Gephyrin表達(dá)則明顯下降[33]。由此可見，Gephyrin表達(dá)水平改變在阿爾茲海默病發(fā)病過程中起一定作用。

鉬輔因子缺乏癥是一種罕見的常染色體隱性遺傳的神經(jīng)代謝性疾病，多兒童期起病，典型臨床表現(xiàn)包括新生兒期難治性癲癇、全身發(fā)育遲緩、肌張力異常及預(yù)期壽命縮短等。病因?yàn)檎{(diào)控鉬輔因子合成的MOCS1、MOCS2、MOCS3或GPHN基因異常所致。Reiss等[9]報(bào)道了一例鉬輔因子缺乏癥，基因檢測MOCS1、MOCS2和MOCS3基因無異常，而GPHN基因存在錯(cuò)義突變，蛋白水平GephyrinE區(qū)的一個(gè)天冬氨酸由丙氨酸替換。驚跳癥是一種罕見的非癲癇性的神經(jīng)源性疾病，特征臨床表現(xiàn)是突然的視覺、聽覺、觸覺刺激后過度的持續(xù)性驚嚇反應(yīng)。在驚跳癥患者發(fā)現(xiàn)編碼GlyR的α1、β亞基、CB蛋白、甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2、Gephyrin的基因突變[34]。

3.2 Gephyrin與精神疾病

日本一項(xiàng)關(guān)于精神分裂癥的病例對照研究中的基因檢測結(jié)果示，Gabra1和GPHN基因與精神分裂癥密切相關(guān)，推測GABAAR亞基和Gephyrin功能異常損害GABA能神經(jīng)環(huán)路，擾亂了正常的神經(jīng)發(fā)育，最終導(dǎo)致精神分裂癥的發(fā)生[35]。

Isshiki等[36]用PSD95-GFP和gephyrin-GFP分別標(biāo)記自閉癥模型小鼠興奮性和抑制性突觸后發(fā)現(xiàn)，興奮性/抑制性突觸比例發(fā)生變化，推測興奮性/抑制性突觸比例的變化可能參與自閉癥的發(fā)生。但NLG R451C和patDP/+小鼠在興奮性和抑制性突觸的變化并不一致，patDP/+(15q11-13重復(fù))小鼠抑制性突觸增加，NLG R451C(NLGN-3突變)并無明顯變化，潛在原因需要更進(jìn)一步研究。

靶向敲除Gabrg2的大鼠不會(huì)引起急性突觸功能缺損，而在特定時(shí)期引起GABA能神經(jīng)傳遞的改變，最終引起焦慮、抑郁等改變，推測是損害Gephyrin聚集和下游的信號(hào)通路引起[37]。

4 小結(jié)

Gephyrin作為CNS抑制性突觸后蛋白網(wǎng)絡(luò)的核心骨架蛋白，在抑制性突觸形成、可塑性、神經(jīng)傳遞的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，參與癲癇、精神分裂癥等神經(jīng)精神疾病的發(fā)病。目前對Gephyrin的認(rèn)識(shí)還很有限，雖已知Gephyrin與CNS抑制性突觸關(guān)系密切，但Gephyrin通過什么信號(hào)通路調(diào)節(jié)抑制性突觸形成、可塑性等，Gephyrin在癲癇、精神分裂癥等神經(jīng)精神疾病發(fā)病過程中起何種作用，均不十分明確。進(jìn)一步研究Gephyrin將有助于更好地認(rèn)識(shí)突觸形成、可塑性、神經(jīng)傳遞以及Gephyrin異常相關(guān)神經(jīng)精神疾病的發(fā)病機(jī)制。我們可以根據(jù)Gephyrin的選擇性剪切、調(diào)節(jié)Gephyrin聚集的特定信號(hào)通路等方面來尋找針對性治療策略，減輕Gephyrin結(jié)構(gòu)和功能缺陷，治療Gephyrin異常相關(guān)神經(jīng)精神疾病，這需要廣大學(xué)者的共同努力。