紀海玉，馮瑩瑩，于娟，彭雪麗，董曉丹，劉安軍

（天津科技大學食品工程與生物技術(shù)學院，天津300457）

肝癌是世界三大惡性腫瘤之一，每年因肝癌死亡的60萬病例中至少有30萬發(fā)生在中國，目前尚未有有效治療肝癌的辦法[1-4]。人肝癌細胞系HepG2細胞最初從人肝母細胞癌中分離出來，能夠保留人肝細胞特征，展現(xiàn)出健康肝細胞的形態(tài)[5]。目前研究藥物對貼壁腫瘤細胞抑制作用普遍用方瓶，但方瓶細胞培養(yǎng)量，細胞分布稀疏，與腫瘤細胞實際生長環(huán)境差異較大，因此我們通過滾瓶對其進行培養(yǎng)，不僅可提高細胞培養(yǎng)效率，更可使細胞生長密集，更接近其體內(nèi)生長狀態(tài)。

硒是人和動物體內(nèi)都必不可缺少的微量元素在免疫反應中起著重要作用[6-7]。復方硒多糖在預防和治療多種腫瘤、心腦血管疾病以及自身免疫性疾病方面具有較為顯著的成效，孫國棟等[8]研制的香菇硒多糖膠囊，在治療急性病毒性肝炎過程中可作為輔助藥物，彰顯出良好的臨床效果。殼聚糖是自然界中發(fā)現(xiàn)的豐富且可再生、可降解的生物聚合物，通常被認為具有生物相容性和無毒性[9-10]，硒酸殼聚糖是利用天然殼聚糖與無機硒制備而成的有機硒化產(chǎn)物，可通過正負電荷間的作用、保持機體微環(huán)境呈弱堿性、抑制腫瘤細胞生長和轉(zhuǎn)移等方式達到抗腫瘤功效。鄧守恒等[11]發(fā)現(xiàn)硒酸殼聚糖能夠有效地抑制K562細胞的生長，Hector Estevez等[12]研究發(fā)現(xiàn)納米級的硒化殼聚糖可將HepG2細胞阻滯在S-G2/M期從而誘導其發(fā)生凋亡。

響應面分析法（response surface methodology，RSM）能夠精確地表述因素和響應值之間的關(guān)系，是一種優(yōu)化反應條件的有效方法[13-14]。鑒于目前對硒酸殼聚糖的研究集中在其誘導腫瘤細胞凋亡的機制，而關(guān)于腫瘤細胞大規(guī)模培養(yǎng)以及同一濃度藥物對不同數(shù)量的細胞的影響研究鮮有報道。本試驗通過響應面法優(yōu)化得到HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)最佳條件，并通過MTT實驗探索硒酸殼聚糖對不同培養(yǎng)條件的HepG2細胞生長的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人肝癌HepG2細胞株：中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所。

DMEM干粉培養(yǎng)基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；二甲基亞砜（DMSO）：北京索萊寶生物科技有限公司；噻唑藍（MTT）：Sigma公司。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺：Thermo Scientific有限公司；PYC-30 CO2培養(yǎng)箱、CGIII-30-F細胞轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)器、滾瓶（410mm，Ф 110）：美國精騏有限公司；立式高壓滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械有限公司；生物顯微鏡：上海中恒儀器有限公司；滾瓶觀察臺：上海山富科學儀器有限公司；酶標儀：美國Bio-Rad。

1.3 方法

1.3.1 HepG2細胞株的日常維系

將人肝癌細胞HepG2培養(yǎng)在含10%胎牛血清、青霉素鏈霉素各為100 U/mL的DMEM培養(yǎng)基中，在CO2濃度為5%的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[15]。每隔1天～2天或在培養(yǎng)基變?yōu)闇\黃色時換一次液。當細胞生長至占瓶底面積的80%時，進行細胞傳代。在超凈臺內(nèi)操作，先棄去舊培養(yǎng)基，用生理鹽水輕輕洗2次后，加入適量胰蛋白酶-EDTA消化，在顯微鏡下觀察到細胞變圓后，迅速加入新的培養(yǎng)基，終止消化。用移液槍將細胞吹下，轉(zhuǎn)于離心管中，在1 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，棄去上清，新培養(yǎng)基重懸后，用血球計數(shù)板進行細胞計數(shù)，最后按合適比例傳代。

1.3.2 單因素試驗

本試驗中選用直徑11 cm、長41 cm、表面積為1 416 cm2規(guī)格的滾瓶。固定初始細胞培養(yǎng)條件為溫度37℃，二氧化碳濃度5%，培養(yǎng)基用量100 mL，接種量3×107個/瓶，培養(yǎng)時間 48 h，滾瓶轉(zhuǎn)速 15 r/min。然后分別考察接種量、培養(yǎng)時間和滾瓶轉(zhuǎn)速3個因素對HepG2細胞培養(yǎng)的影響。

1.3.2.1 接種量的探索

分別以接種量為每滾瓶 1×107、2×107、3×107、4×107、5×107個/瓶的細胞進行傳代，每滾瓶中加入 100 mL培養(yǎng)基。

1.3.2.2 培養(yǎng)時間的確定

在HepG2細胞傳于滾瓶后，分別將其培養(yǎng)24、36、48、60、72 h 后，進行細胞計數(shù)。

1.3.2.3 滾瓶轉(zhuǎn)速的研究

HepG2 細胞傳于滾瓶后，分別以 5、10、15、20、25 r/min的速度培養(yǎng)，然后進行細胞計數(shù)。

1.3.3 HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果及Box-Behnken試驗設計原理，以接種量、培養(yǎng)時間、滾瓶轉(zhuǎn)速為自變量，以HepG2細胞培養(yǎng)量為響應值，利用Design-Expert8.0軟件進行三因素三水平響應試驗設計（見表1）。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface methodology

1.3.4 MTT法測硒酸殼聚糖對細胞的增殖抑制作用

96孔板培養(yǎng)：取對數(shù)生長期HepG2細胞加入96孔板中，每孔約4 000～5 000個細胞共100 μL，待細胞生長至70%～80%并具有多于90%的細胞存活率時，向96孔板中加入硒酸殼聚糖溶液，使終濃度分別為25、50、100、200、400、800 μg/mL，陽性對照組為 5-氟尿嘧啶，培養(yǎng)24 h，于培養(yǎng)結(jié)束之前4 h加入20 μL MTT，再培養(yǎng)4 h后離心，終止后棄去孔內(nèi)的上清液，每孔加入150 μL DMSO，然后將其置于震蕩器上震搖10 min。待孔內(nèi)的結(jié)晶物溶解之后，立即用酶標儀在波長490 nm處對吸光度進行測定。

滾瓶培養(yǎng)：取4×107個HepG2細胞傳入到1個滾瓶中，加入100 mL培養(yǎng)基。48 h后將細胞用含EDTA的胰蛋白酶消化下來，用DMEM培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min的轉(zhuǎn)速下離心5 min棄去上清液，用DMEM培養(yǎng)基對細胞進行重懸，然后將重懸的細胞均勻分成7份分別傳到7個滾瓶中，補充培養(yǎng)基至終體積為100 mL，培養(yǎng)48 h后對7個滾瓶的細胞中加入硒酸殼聚糖溶液，使其終濃度分別為 25、50、100、200、400、800 μg/mL 以及 5-氟尿嘧啶（5-Fu），培養(yǎng) 24 h，于培養(yǎng)結(jié)束之前4 h進行收細胞的操作。根據(jù)96孔板培養(yǎng)經(jīng)驗，取約5×104個細胞加入到96孔板的一個孔中，用DMEM培養(yǎng)基補足體積至200 μL，再加入20 μL MTT工作液（終濃度為0.5 mg/mL），在溫度為37℃、CO2含量為5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，后將96孔板在1 500 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，每孔棄150 μL上清，加150 μL DMSO。96孔板經(jīng)振蕩器震蕩10 min后，用酶標儀在490 nm下進行檢測。計算抑制率及用SPSS軟件計算IC50值。抑制率計算如下：

抑制率/%=（OD1-OD2）/OD1×100

式中：OD1為空白組細胞吸光值；OD2為加藥組細胞吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗數(shù)據(jù)為3次重復實驗的平均值，采用O-rigin 9.0作圖，SPSS Statistics 18.0、Design-Expert 8.0進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 起始接種量對HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)產(chǎn)量的影響

接種量對HepG2細胞產(chǎn)量的影響見圖1。

如圖1所示，HepG2細胞隨著接種量的變化呈先增加后下降的趨勢。當接種量為1×107個/瓶及2×107個/瓶時，HepG2細胞的形態(tài)完好且培養(yǎng)基透亮，細胞狀態(tài)好，但產(chǎn)量低，生長較稀疏，當接種量為5×107個/瓶時，接種量過多使得培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)消耗速度加快，代謝產(chǎn)物增加，甚至發(fā)生細胞脫落，因而產(chǎn)量降低。最佳接種量應該在4×107個/瓶左右。

圖1 接種量對HepG2細胞產(chǎn)量的影響Fig.1 Effects of inoculation amounts on the HepG2 cells yield

2.1.2 培養(yǎng)時間對HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)時間對HepG2細胞產(chǎn)量的影響如圖2所示。

圖2 培養(yǎng)時間對HepG2細胞產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of incubation time on the HepG2 cells yield

如圖2所示，隨著培養(yǎng)時間的增加，滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞的產(chǎn)量是先升高后下降的，細胞培養(yǎng)時間為24 h時，細胞未鋪滿滾瓶壁；培養(yǎng)時間為36 h時，細胞單層生長，基本鋪滿滾瓶壁，細胞狀態(tài)也完好；培養(yǎng)時間為48 h后，部分細胞堆積生長，細胞狀態(tài)良好；當培養(yǎng)72 h后，細胞代謝產(chǎn)物增加，多層細胞堆積，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，細胞開始脫落、死亡。因此最佳培養(yǎng)時間在48 h左右。

2.1.3 滾瓶轉(zhuǎn)速對HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)產(chǎn)量的影響

滾瓶轉(zhuǎn)速對HepG2細胞培養(yǎng)產(chǎn)量的影響結(jié)果如圖3所示。

如圖3所示，隨著滾瓶轉(zhuǎn)速的提高，HepG2細胞培養(yǎng)量是先增加后下降的。當滾瓶轉(zhuǎn)速為5 r/min時，由于轉(zhuǎn)速過低，部分細胞未能及時接觸培養(yǎng)基，從而缺乏營養(yǎng)物質(zhì)死亡。當轉(zhuǎn)速為20 r/min～25 r/min時，轉(zhuǎn)速太快，部分細胞未能成功貼壁，因而不能生長增殖，使細胞產(chǎn)量低。較為合適的轉(zhuǎn)速在10 r/min左右。

圖3 滾瓶轉(zhuǎn)速對HepG2細胞產(chǎn)量的影響Fig.3 Effects of rotate speed on the HepG2 cells yield

2.2 響應面實驗結(jié)果

2.2.1 數(shù)學模型的建立

響應面試驗設計及結(jié)果見表2。

表2 響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

單因素試驗結(jié)果表明，培養(yǎng)的條件為：接種量4×107個/瓶，培養(yǎng)時間48 h，滾瓶轉(zhuǎn)速為10 r/min時，滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞的產(chǎn)量最高。因此如表2所示，將接種量、培養(yǎng)時間、滾瓶轉(zhuǎn)速作為研究對象條件，以HepG2細胞培養(yǎng)量為響應值，得到17組實驗點。13組為析因點，4組為中心點。采用Design-Expert8.0軟件進行分析，得到HepG2細胞培養(yǎng)量對以上因素的二次多項回歸模型為：Y=10.43-0.04A-0.96B+0.15C-0.66AB-0.61AC-0.12BC-0.54A2-1.91B2-1.32C2。二次回歸模型方差分析結(jié)果見表3。

表3 二次回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variancef the quadratic regression model

由表3方差分析可知，模型的p值顯著，失擬項P為0.745 6，差異不顯著，說明該模型能夠明顯優(yōu)化滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞。R2為0.976 7，調(diào)整后R2為0.946 7，說明證明該模型能解釋97.7%的結(jié)果值的變化規(guī)律，基本可用于HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)，試驗誤差小，能夠反映響應值的變化。由表3，我們還可看出，在本實驗設計中 B、AB、B2、C2項均為極顯著（p＜0.01），AC、A2項為顯著（p＜0.05），A、C、BC 項為不顯著。

2.2.2 響應面分析結(jié)果

各因素之間的交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖見圖4。

響應面法能夠根據(jù)二次方程模型分別做出試驗因素間交互作用的三維立體響應曲面和等高線圖[15]。響應面曲面可以較直觀地反映各因素及兩兩因素交互作用對響應值的影響。因素對響應值影響越大，曲面越陡峭，等高線的稀疏程度顯示響應面曲面圖的平陡[16-18]。等高線的形狀能夠反映兩因素之間影響，橢圓形表示因素的交互作用顯著，圓形則表示交互作用不顯著[19]。由圖4可知通過響應面的陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)，滾瓶轉(zhuǎn)速對HepG2細胞的生長量影響最大，其次是接種量和培養(yǎng)時間，這與方差分析結(jié)果一致。滾瓶轉(zhuǎn)速和接種的交互影響最大。

根據(jù)響應面軟件分析，可從回歸模型中得到最HepG2滾瓶培養(yǎng)的優(yōu)培養(yǎng)條件：接種量4.11×107個/瓶，培養(yǎng)時間48.51 h，滾瓶轉(zhuǎn)速8.64 r/min，此條件下HepG2細胞產(chǎn)量預測值10.56×107個/瓶，在此條件下進行驗證實驗（3個平行實驗），得到實際細胞量為10.88×107個/瓶。與理論預測值相比，其相對誤差約為3.03%，說明模型該可以較好地優(yōu)化HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)的條件。

圖4 各因素交互作用的響應面與等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the effect of various incubation conditions on the yield of HepG2 cell

2.3 硒酸殼聚糖對細胞的增殖抑制作用分析

硒酸殼聚糖對HepG2細胞的抑制作用結(jié)果見圖5。

由圖5我們可知，無論是孔板培養(yǎng)和滾瓶培養(yǎng)，硒酸殼聚糖的濃度在 25 μg/mL～200 μg/mL 范圍內(nèi)時，隨著硒酸殼聚糖濃度的增加，其對HepG2細胞的增殖抑制率呈明顯增強的趨勢；在硒酸殼聚糖作用的濃度為200 μg/mL～800 μg/mL時，隨著硒酸殼聚糖作用濃度的增加其對HepG2的增殖抑制率也呈上升的態(tài)勢，但明顯趨向于平緩，原因可能是當硒酸殼聚糖藥物濃度達到200 μg/mL時，HepG2細胞幾乎全被抑制，也只是稍低于用于癌癥治療的藥物5-Fu的效果。但這說明硒酸殼聚糖對HepG2細胞有著促凋亡作用。經(jīng)計算可得出硒酸殼聚糖對96孔板和滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞IC50值分別為 169 μg/mL 和 245 μg/mL，滾瓶培養(yǎng)的細胞的IC50值明顯高于孔板培養(yǎng)組，這是因為孔板培養(yǎng)HepG2細胞，細胞只能按層平鋪生長，而滾瓶培養(yǎng)的細胞發(fā)生聚集，能夠疊著長成小肉瘤形態(tài)，更接近宿主體內(nèi)腫瘤細胞的生長狀態(tài)，表明大量細胞聚集可產(chǎn)生藥物拮抗作用。由于硒酸殼聚糖的天然性和良好的抑癌效果，所以極具研究價值。

圖5 硒酸殼聚糖在不同作用濃度不同作用時間下對HepG2細胞的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of seleno-chitosan on HepG2 cells in different concentrations at different time

3 結(jié)論

本研究以HepG2細胞培養(yǎng)量為評價指標，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面優(yōu)化試驗得出HepG2細胞滾瓶培養(yǎng)的最佳條件為接種量4.11×107個/瓶，培養(yǎng)時間48.51 h，滾瓶轉(zhuǎn)速8.64 r/min時，HepG2細胞培養(yǎng)量最高，為10.56×107個/瓶，驗證實驗得到實際細胞量為10.88×107個/瓶，與理論預測值相近。說明響應面法對滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞的培養(yǎng)條件的優(yōu)化是可行的。

多糖具有良好的抗腫瘤或抗氧化活性，副作用小，是治療一些常見疾病甚至腫瘤的替代藥物之一[20]。很多學者也證實了硒多糖具有抗腫瘤活性，Mao Guanghua等[21]發(fā)現(xiàn)Se-GP11多糖可以通過改善荷瘤小鼠的免疫功能來提高抗腫瘤作用；Wang Junlong等[22]的研究中發(fā)現(xiàn)SeASPMW多糖對人H1650肺癌細胞的生長產(chǎn)生抑制作用；Yang Shengli等[23]從蟬分離得到的富硒胞外多糖Se-CEPS能夠抑制結(jié)腸癌CT26細胞的生長。通過MTT實驗我們發(fā)現(xiàn)硒酸殼聚糖對HepG2肝癌細胞生長具有明顯抑制作用，對96孔板和滾瓶培養(yǎng)HepG2細胞IC50值分別為169 μg/mL和245 μg/mL，說明細胞在滾瓶培養(yǎng)條件下可發(fā)生聚集現(xiàn)象，從而產(chǎn)生對藥物的拮抗作用。該實驗結(jié)果為抗腫瘤疫苗研發(fā)及腫瘤藥物治療提供理論依據(jù)。

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