張艷萍，令利軍，趙 瑛，厚毅清

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，甘肅 蘭州 730070；2.西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅蘭州 730070）

馬鈴薯晚疫病是由致病疫霉［Phytophthora infestans（Mont.）de Bary］引起的一種毀滅性的病害，嚴(yán)重影響著馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-2］。目前，馬鈴薯晚疫病防治主要包括化學(xué)防治、抗病育種等［3］。隨著科學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展進(jìn)步，利用生物種間關(guān)系、種內(nèi)關(guān)系，調(diào)節(jié)有害生物種群密度的生物防治手段越來(lái)越受到人們的重視，這種生物防治措施具有安全、有效和無(wú)污染等特點(diǎn)，與保護(hù)生態(tài)環(huán)境和社會(huì)協(xié)調(diào)發(fā)展的要求相吻合［4］。

我們從土壤中分離得到1株對(duì)馬鈴薯晚疫病菌具有良好抑制作用的假單胞菌，并命名為HC5。假單胞菌在自然界分布廣泛，種類(lèi)繁多，是植物根際土壤周?chē)鹕锓乐喂δ艿闹饕?xì)菌類(lèi)群［5］。目前，關(guān)于假單胞菌的應(yīng)用研究有了大量的報(bào)道［6-12］，它們可以產(chǎn)藤黃綠膿素（pyoluteorin，Plt）、吡咯菌素（pyrrolnitrin，Prn）、1-羧基吩嗪（phenazine-lcaboxylic acid，PCA） 等多種抗生素，對(duì)多種病菌具有拮抗作用［13］，涉及領(lǐng)域包括用于農(nóng)業(yè)生物防治、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)、環(huán)境保護(hù)和醫(yī)藥開(kāi)發(fā)等［14-16］。我們從假單胞菌HC5發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力和HC5發(fā)酵液在不同溫度、pH以及紫外線照射時(shí)間下對(duì)馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性方面進(jìn)行了研究，以期為菌株HC5在馬鈴薯晚疫病菌防治方面的應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株HC5從土樣中分離篩選獲得。供試馬鈴薯晚疫病菌由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供。

1.2 培養(yǎng)基

試驗(yàn)所用的培養(yǎng)基為黑麥西紅柿培養(yǎng)基（HX）：黑麥60 g、西紅柿汁100mL、碳酸鈣0.4 g、瓊脂15 g，加水至1 L。發(fā)酵用培養(yǎng)液為液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）：牛肉浸膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g，加水至1 L，pH 7.0。

1.3 菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的拮抗測(cè)定

采用皿內(nèi)涂布法、平板對(duì)峙法和胞外分泌物平板滲透法分別研究，并用抑菌率評(píng)價(jià)菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力。抑菌率=［（對(duì)照菌落半徑－處理菌落半徑）/對(duì)照菌落半徑］×100%。

1.3.1 皿內(nèi)涂布法 將制備好的HC5菌株發(fā)酵菌液50 μL均勻涂布在直徑為9cm的HX平板中，隨后在平板中央接入直徑為0.5cm的馬鈴薯晚疫病菌餅，20℃左右黑暗培養(yǎng)10 d，測(cè)量病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑菌率。取50 μL的無(wú)菌培養(yǎng)液涂布于HX平板中，接種病原菌塊為對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 平板對(duì)峙法 在直徑為9cm的HX平板中心接種直徑為0.5cm的馬鈴薯病原菌餅，20℃左右黑暗培養(yǎng)7 d后，在距中央2.5cm處接入浸有菌株HC5發(fā)酵菌液、直徑為5mm的濾紙圓片，20℃左右黑暗繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)接種無(wú)菌培養(yǎng)液的處理為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。10 d后測(cè)量病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑菌率。

1.3.3 平板滲透法 將菌株HC5在液體NA培養(yǎng)基上振蕩培養(yǎng)2～3d，180 r/min，28℃。發(fā)酵后的菌液離心去除菌絲，12 000 r/min，10min。取上清液，用0.22 μm無(wú)菌過(guò)濾器過(guò)濾，獲得胞外分泌物原液。將分泌物原液按1∶10的比例加入到HX培養(yǎng)基中，混勻制成平板。然后將直徑0.5cm的馬鈴薯病原菌餅接種于中央，20℃左右黑暗培養(yǎng)10d。設(shè)加入無(wú)菌培養(yǎng)液到HX培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次。10 d后測(cè)量病原菌的菌落半徑，計(jì)算抑菌率。

1.4 菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌抑制穩(wěn)定性的測(cè)定

采用平板滲透法進(jìn)行菌株HC5胞外分泌物對(duì)馬鈴薯晚疫病菌抑制作用穩(wěn)定性研究。設(shè)加入無(wú)菌培養(yǎng)液到培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對(duì)照1；加入不經(jīng)過(guò)各項(xiàng)處理的胞外分泌物到培養(yǎng)基中制成的平板，接入病原菌餅的為對(duì)照2。

1.4.1 不同溫度處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物在40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃溫度條件下分別處理10min、20min、30min后，加入培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，每處理均重復(fù)3次。

1.4.2 不同pH處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物用1MNaOH或1MHCl調(diào)整到處理所需的pH：3.0、5.0、7.0、9.0、11.0，分別處理2 h、3 h、4 h后，再用1MNaOH或1MHCl調(diào)整到pH為7.0，隨后加入培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，每處理均重復(fù)3次。

1.4.3 紫外線處理后的抑制作用 將菌株HC5的胞外分泌物在紫外燈下20cm處照射30min、60min、90min、120min、150min后，加入培養(yǎng)基中進(jìn)行試驗(yàn)測(cè)定，每處理均重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的拮抗效果

采用皿內(nèi)涂布法、平板對(duì)峙法和胞外分泌物平板滲透法分別評(píng)價(jià)了菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力，結(jié)果顯示，菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌有很強(qiáng)的抑制作用。如圖1，接入菌株HC5后，馬鈴薯晚疫病原菌幾乎不生長(zhǎng)，抑菌率基本都在100%。

圖1 不同方法菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制效果

2.2 菌株HC5對(duì)馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性

2.2.1 不同溫度處理對(duì)抑制作用的影響 如圖2所示，菌株HC5胞外分泌物在40℃和50℃下處理10min、20min、30min，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌依然有較好的抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌幾乎不生長(zhǎng)；從60℃開(kāi)始到100℃，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用就受到影響，不論是10min的短時(shí)間處理還是30min的長(zhǎng)時(shí)間處理，均破壞了抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌生長(zhǎng)狀態(tài)和對(duì)照無(wú)差別。

2.2.2 不同pH處理對(duì)抑制作用的影響 如圖3所示，菌株HC5胞外分泌物在pH 5.0～11.0處理下，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用沒(méi)有影響，馬鈴薯晚疫病菌受到抑制，幾乎不生長(zhǎng)；在pH 3.0處理下，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用有影響，破壞了抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌生長(zhǎng)正常。

圖2 不同溫度處理對(duì)抑制作用的影響

圖3 不同pH處理對(duì)抑制作用的影響

2.2.3 紫外線處理對(duì)抑制作用的影響 如圖4所示，菌株HC5胞外分泌物在紫外線下照射，不論是30min的短時(shí)間處理還是120min的長(zhǎng)時(shí)間處理，對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制作用均沒(méi)有影響，依然有較好的抑制作用，馬鈴薯晚疫病菌幾乎不生長(zhǎng)。

圖4 紫外線處理對(duì)抑制作用的影響

3 小結(jié)與討論

為了豐富馬鈴薯晚疫病的生物防治資源數(shù)據(jù)庫(kù)，我們從土壤中分離篩選，獲得了對(duì)馬鈴薯晚疫病菌具有較強(qiáng)拮抗作用的假單胞菌HC5。采用皿內(nèi)涂布法、平板對(duì)峙法和平板滲透法分別評(píng)價(jià)了HC5菌株發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯晚疫病菌的抑制能力。結(jié)果顯示，不同方法下，菌株HC5發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯晚疫病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用。采用平板滲透法進(jìn)一步研究了菌株HC5發(fā)酵液在不同溫度、pH以及紫外線照射時(shí)間對(duì)馬鈴薯晚疫病菌抑制的穩(wěn)定性，結(jié)果顯示，菌株HC5發(fā)酵液在溫度50℃以下，pH 5～11，紫外線照射120min均對(duì)馬鈴薯晚疫病菌具有抑制作用，表現(xiàn)出的耐受穩(wěn)定性較強(qiáng)，具有應(yīng)用潛力。

國(guó)外對(duì)馬鈴薯晚疫病生物防治的研究較早。Filippov已將Pseudomonas putida和Bacillus subtilis應(yīng)用于馬鈴薯晚疫病的防治中［17］。Jindal K等測(cè)試了從葉表面分離得到的6種真菌對(duì)P.infestans有抑制作用［18］。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)在生防菌防治晚疫病方面也有一些報(bào)道。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治所楊懷文等［19］報(bào)道嗜線蟲(chóng)致病桿菌發(fā)酵液對(duì)P.in－festans有一定的抑制作用；王樹(shù)桐［20-22］研究了88種中草藥的抑菌活性，并進(jìn)一步研究了知母提取物對(duì)致病疫霉抑菌作用及抑菌機(jī)制；蔣繼志等［23-24］研究發(fā)現(xiàn)，8種真菌發(fā)酵液和大蒜、洋蔥、丁香等植物離體組織及其提取物對(duì)馬鈴薯晚疫病病菌也都有強(qiáng)烈抑制作用?？梢?jiàn)微生物群已經(jīng)可以作為尋找和研制馬鈴薯晚疫病生物拮抗制劑的重要資源。

本研究通過(guò)拮抗性實(shí)驗(yàn)表明，HC5的發(fā)酵液中可能分泌有某些抗生素而抑制植物病原菌的生長(zhǎng)，具體是什么物質(zhì)還有待進(jìn)一步研究。在本研究中，該菌表現(xiàn)具有較強(qiáng)的耐高溫和耐堿等特點(diǎn)，受環(huán)境的影響較小，防效比較穩(wěn)定，這一結(jié)果為后期將其應(yīng)用于生物農(nóng)藥研發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

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