李亞莉，侯 棟，岳宏忠，張東琴

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070）

黃瓜是世界范圍內(nèi)廣泛栽培的重要蔬菜作物之一，中國(guó)黃瓜栽培面積位居全國(guó)保護(hù)地栽培面積之首，對(duì)中國(guó)蔬菜市場(chǎng)的穩(wěn)定和蔬菜的均衡供應(yīng)起到了非常關(guān)鍵的作用［1］。土傳病害是植物病害研究領(lǐng)域的難題［2］，而在黃瓜栽培中，枯萎病是一種嚴(yán)重的土傳病害［3］。黃瓜枯萎病由尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum f.sp.cucumerinum Owen）引起，又名萎蔫病、蔓割病、死秧病，是一種由土壤傳染，從根或根莖部侵入，在維管束內(nèi)寄生的系統(tǒng)性病害［4-7］。由于土傳病害以土壤為媒介進(jìn)行傳播，具有極強(qiáng)的隱蔽性，同時(shí)尖孢鐮刀菌對(duì)不良環(huán)境具有較強(qiáng)抵抗力，以菌絲體、厚垣孢子等在土壤中存活5～6 a之久［8］，在土壤和空氣中能夠存活10 a以上且仍具有很強(qiáng)的致病力［9］，在溫度、濕度和pH等適宜的條件下，能重新快速繁殖，導(dǎo)致病害發(fā)生。該病一旦發(fā)生將產(chǎn)生嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，病害發(fā)生嚴(yán)重時(shí)甚至絕收，因此黃瓜枯萎病的防治一直是黃瓜病害防治的難點(diǎn)［10-11］。目前，沒(méi)有防治黃瓜枯萎病的特效藥，輪作倒茬雖然有效，但給蔬菜生產(chǎn)者的茬口安排帶來(lái)了實(shí)際困難；嫁接防治枯萎病要掌握一定的嫁接技術(shù)，且成本較高，相比之下，選育抗病品種才是防治黃瓜枯萎病最經(jīng)濟(jì)、安全、高效的措施［12-13］。而種質(zhì)資源的抗病性鑒定及明確抗性遺傳規(guī)律是選育抗病品種的基礎(chǔ)。2015—2016年，甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所以保存的33份黃瓜核心種質(zhì)為試材，通過(guò)苗期接種和成株期自然感染兩種方法，客觀評(píng)價(jià)其抗病、感病水平，以期篩選出一些抗病種質(zhì)，進(jìn)一步明確黃瓜枯萎病的抗性遺傳特性，將利用雜交、回交等遺傳改良手段，實(shí)現(xiàn)材料的快速創(chuàng)新，為選育抗枯萎病的黃瓜品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試黃瓜種質(zhì)33份及6份F1代雜交組合。對(duì)照抗病品種為迷你1號(hào)，感病對(duì)照品種為京研2號(hào)，以上材料均由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所黃瓜育種課題提供。供試菌種為尖孢鐮刀菌黃瓜?；?［Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.cucumerinum Owen.］生理小種4號(hào)，由北京農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 苗期抗性鑒定 苗期抗性鑒定采用胚根接種法［14］，稍有改動(dòng)。孢子懸浮液的制備：將保存?zhèn)溆玫木N接種到PDS培養(yǎng)基中，待培養(yǎng)皿中布滿菌絲后，倒入少許滅菌水，刮取菌絲，用雙層紗布過(guò)濾，除去菌絲，將濾液經(jīng)5 000 rpm離心10min，取其沉淀物，加蒸餾水稀釋成1×106個(gè)/mL的孢子懸浮液，備用。接種方法：將催芽后胚根長(zhǎng)約1cm的種子，浸入配制好的孢子懸浮液中30min，然后傾出孢子懸浮液，將種子播于育苗盤中。試驗(yàn)隨機(jī)區(qū)組排列，3次重復(fù)，每重復(fù)10株苗。每天視基質(zhì)濕度適量澆水，并隨機(jī)挪動(dòng)育苗盤，觀察幼苗的發(fā)病情況。在感病對(duì)照品種發(fā)病盛期進(jìn)行調(diào)查，調(diào)查2次，求平均值。病情調(diào)查及分級(jí)：0級(jí)，無(wú)病癥；1級(jí)，胚軸及子葉癥狀輕微，子葉失去光澤；2級(jí)，植株輕度萎蔫，胚軸出現(xiàn)壞死斑，或一片子葉黃化；3級(jí)，植株中度萎蔫，子葉下垂或僵化；4級(jí)，植株嚴(yán)重萎蔫，倒伏枯死或不出苗（爛種）。

1.2.2 成株期抗性鑒定 于每年3月中旬播種，待黃瓜苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，移栽到甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所多年重茬、枯萎病多發(fā)的塑料大棚中自然誘病。鑒定圃人工開(kāi)畦，四周設(shè)寬1 m的保護(hù)區(qū)，畦寬60cm，溝寬60cm，畦長(zhǎng)3.3 m，3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列，小區(qū)面積4 m2，每小區(qū)24株。生育期對(duì)黃瓜的性型、瓜皮色、瓜形、瓜刺色、瓜瘤大小、瓜刺瘤稀密進(jìn)行調(diào)查，性型分為強(qiáng)雌和雌雄，瓜皮色分為綠、淺綠、白綠，瓜形分為短圓筒、短棒，瓜刺色均為白色，瓜瘤大小分為無(wú)、中、大，瓜刺瘤稀密分為稀、密。于黃瓜拉秧前調(diào)查枯萎病的病情指數(shù)，每小區(qū)24株全部調(diào)查，每株連根拔起，記載發(fā)病嚴(yán)重度。分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［15］：0級(jí)，根、莖、葉生長(zhǎng)正常；1級(jí)，1/4以下根、莖變黃，植株稍有矮化；2級(jí)，1/4～1/2根、莖變黃，下部葉脈褪色；3級(jí)，1/2～3/4根、莖變黃，莖基縱裂；4級(jí)，3/4以上根、莖變黃或直接枯萎死亡。

1.2.3 病情指數(shù)計(jì)算公式

病情指數(shù)=Σ（病情嚴(yán)重程度×株數(shù)）/（最高病情嚴(yán)重程度×調(diào)查總株數(shù)）×100

1.2.4 抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) 抗性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)［16］：高抗（HR），0＜DI≤10；抗病（R），10＜DI≤30；中抗（MR），30＜DI≤50；感病（S），50＜DI≤70；高感（HS），DI＞70。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃瓜種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性反應(yīng)

評(píng)價(jià)結(jié)果（表1）表明，供試黃瓜種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性存在差異，對(duì)照“迷你1號(hào)”表現(xiàn)為抗病，而“津研2號(hào)”表現(xiàn)為高感。在33份黃瓜種質(zhì)中，具有高抗枯萎病的種質(zhì)3份，占9.09%，抗病種質(zhì)11份，占33.33%，中抗種質(zhì)7份，占21.21%，感病種質(zhì)10份，占30.30%，高感種質(zhì)2份，占6.06%。

2.2 黃瓜枯萎病抗性分布頻率分析

進(jìn)一步分析黃瓜種質(zhì)的抗性分布頻率（表2），結(jié)果表明，33份黃瓜種質(zhì)中，華北型黃瓜3份，均為中抗；歐洲溫室型和歐洲華南雜交型高抗種質(zhì)所占比例較高，分別為26.00%和16.67%；14份華南型黃瓜，未發(fā)現(xiàn)高抗種質(zhì)，且感病和高感種質(zhì)所占比例分別為50.00%、14.29%，均高于歐洲溫室型和歐洲華南雜交型，說(shuō)明具有歐洲溫室型親緣關(guān)系的黃瓜種質(zhì)較華南型種質(zhì)抗枯萎病。強(qiáng)雌黃瓜高抗和抗病種質(zhì)所占比例分別為13.33%和53.33%，均高于雌雄黃瓜；雌雄黃瓜感病和高感種質(zhì)所占比例分別為38.89%和11.11%，均高于強(qiáng)雌黃瓜，說(shuō)明強(qiáng)雌黃瓜較雌雄黃瓜抗枯萎病。綠、淺綠和白綠黃瓜中抗以上所占比例依次降低，分別為90.00%、66.67%和50.00%，且綠皮黃瓜高抗種質(zhì)所占比例為30.00%，23份淺綠和白綠黃瓜的抗性水平均未達(dá)到高抗，說(shuō)明皮色較綠的黃瓜對(duì)枯萎病的抗性較強(qiáng)。3份短棒型黃瓜種質(zhì)，均為中抗；短圓筒黃瓜中抗以上的占比為60.00%，感病和高感種質(zhì)占比為40.00%。33份黃瓜種質(zhì)均為白刺，高抗、抗病、中抗、感病、高感種質(zhì)所占比例分別為9.09%、33.33%、21.21%、30.30%、6.06%。無(wú)瘤、中瘤、大瘤黃瓜種質(zhì)中抗以上所占比例依次降低，分別為75.00%、61.90%、50.00%，且無(wú)瘤黃瓜高抗種質(zhì)所占比例為37.50%，25份中、大瘤黃瓜種質(zhì)，抗性水平均未達(dá)到高抗，說(shuō)明無(wú)瘤黃瓜較中瘤和大瘤黃瓜抗枯萎病。瓜刺瘤稀的種質(zhì)感病和高感所占比例分別為33.33%和6.67%，均高于瓜刺瘤密的種質(zhì)，且瓜刺瘤密的種質(zhì)高抗所占比例為11.11%，高于瓜刺瘤稀的種質(zhì)，說(shuō)明瓜刺瘤密的黃瓜種質(zhì)較刺瘤稀的種質(zhì)抗病。

表1 不同黃瓜種質(zhì)資源對(duì)枯萎病的抗性

表2 不同生態(tài)類型、性型、瓜條性狀的黃瓜種質(zhì)資源對(duì)枯萎病的抗性

2.3 黃瓜枯萎病抗性遺傳特性分析

由表3可以看出，通過(guò)對(duì)6份黃瓜自交系配制6份雜交一代的觀察，雜交一代對(duì)黃瓜枯萎病的抗性程度取決于雙親抗性的高低。自交系材料的枯萎病病指在7.50～80.83范圍內(nèi)，雜交一代的病指在13.33～45.67，并且呈現(xiàn)出抗性加強(qiáng)的趨勢(shì)。由雜交一代的枯萎病病指可知，雙親自交系只要有1個(gè)抗病，雜交一代就表現(xiàn)抗病，其抗病能力介于雙親抗病均值與高抗病親本之間，由此可以說(shuō)明枯萎病抗性基因是由多基因控制的數(shù)量性狀，并且這種性狀可以穩(wěn)定的遺傳給下一代。

表3 親本及雜交1代的病情指數(shù)及超中親值比較

3 小結(jié)與討論

黃瓜種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性存在差異。在供試的33份黃瓜種質(zhì)中，具有高抗枯萎病的種質(zhì)3份，占9.09%；抗病種質(zhì)11份，占33.33%；中抗種質(zhì)7份，占21.21%；感病種質(zhì)10份，占30.30%；高感種質(zhì)2份，占6.06%。進(jìn)一步分析黃瓜種質(zhì)的抗性分布頻率，表明具有歐洲溫室型親緣關(guān)系的黃瓜種質(zhì)較華南型種質(zhì)抗枯萎病，強(qiáng)雌黃瓜較雌雄黃瓜抗枯萎病，皮色較綠的黃瓜對(duì)枯萎病抗性較強(qiáng)，無(wú)瘤黃瓜較中、大瘤黃瓜抗枯萎病，瓜刺瘤密的黃瓜種質(zhì)較刺瘤稀的黃瓜種質(zhì)抗病。3份短棒型黃瓜種質(zhì)均為中抗，短圓筒黃瓜中抗以上所占比例為60.00%，感病和高感種質(zhì)所占比例為40.00%。33份黃瓜種質(zhì)均為白刺，高抗、抗病、中抗、感病、高感種質(zhì)所占比例分別為9.09%、33.33%、21.21%、30.30%、6.06%。

目前認(rèn)為黃瓜枯萎病有4個(gè)生理小種，來(lái)自美國(guó)、以色列和日本的3個(gè)菌株分別鑒定命名為生理小種1、2、3號(hào)［17］。我國(guó)普遍流行的為生理小種4號(hào)［18-20］。國(guó)內(nèi)外黃瓜枯萎病苗期抗性鑒定方法主要有菌土法、胚根接種法、灌根法、浸根法和病原菌毒素濾液浸苗法5種，國(guó)外以菌土法和灌根法使用最普遍［17，21-22］，國(guó)內(nèi)采用較多的是胚根接種法、浸根接種法、灌根接種法［18，23-25］。菌土接種法較簡(jiǎn)單，但病原在基質(zhì)中的濃度均一性難以掌控。病原菌毒素濾液浸苗法操作繁瑣，灌根接種法效果較差，應(yīng)用較少。浸根接種法效果較好，但接種較繁瑣，接種拔苗時(shí)容易傷根，試驗(yàn)結(jié)果難以排除傷根造成萎蔫的可能。而胚根接種法具有操作簡(jiǎn)便，試驗(yàn)時(shí)間短，病害癥狀明顯易調(diào)查，結(jié)果可靠的特點(diǎn)，所以本試驗(yàn)采用胚根接種法。本試驗(yàn)成株期抗性鑒定在甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所多年重茬、枯萎病多發(fā)的塑料大棚中進(jìn)行，該地區(qū)屬于枯萎病常發(fā)區(qū)，且枯萎病發(fā)生非常嚴(yán)重，說(shuō)明鑒定結(jié)果是可信的。與苗期人工接種相比，通過(guò)田間自然感染枯萎病，能客觀反應(yīng)成株期黃瓜種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性水平。本研究表明，33份黃瓜核心種質(zhì)，高抗種質(zhì)僅占5.9%，說(shuō)明枯萎病高抗種質(zhì)很少。因此，應(yīng)不斷收集國(guó)內(nèi)外黃瓜種質(zhì)資源，持續(xù)鑒定和篩選抗枯萎病的種質(zhì)資源，為選育抗枯萎病的品種奠定基礎(chǔ)。本研究表明，不同生態(tài)類型、性型、瓜皮色、瓜形、瓜刺色、瓜瘤大小、瓜刺瘤稀密的黃瓜種質(zhì)對(duì)枯萎病的抗性反應(yīng)不同，因此，在搜集抗枯萎病的黃瓜種質(zhì)時(shí)，可以參考這些性狀進(jìn)行，可使搜集工作更加有效。

自交系本身的抗病性強(qiáng)弱在很大程度上決定了雜交一代抗性的高低，所以應(yīng)建立起培育具有強(qiáng)抗病性的雜交一代的高效選擇體系。本研究表明，黃瓜枯萎病抗性為數(shù)量性狀遺傳，抗性為顯性基因控制，抗病與感病親本的雜交一代抗病性介于雙親抗性均值與強(qiáng)抗病親本之間，抗病性表現(xiàn)出中親優(yōu)勢(shì)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)超親優(yōu)勢(shì)。但也有研究表明黃瓜枯萎病抗性遺傳有超親優(yōu)勢(shì)［26］，這可能與所選材料的不同有關(guān)。在生產(chǎn)中應(yīng)選擇性狀優(yōu)良的抗病性自交系配制雜交一代。其抗病性的強(qiáng)弱往往取決于雙親自交系的來(lái)源、區(qū)域差別及抗病性的強(qiáng)弱。

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