肖　琳，楊海平，鄧先強

（肇慶學院 體育與健康學院，廣東 肇慶　526061）

哺乳動物繼承2套染色體，分別來自父親和母親.對于每個基因，都有2個復(fù)制體.大多數(shù)基因的2個等位基因根據(jù)細胞類型分為表達基因和抑制基因.印記基因成串分布于基因組中，這些印記基因有1個離散的印記控制區(qū)域(ICR)來管理印記表達和父母等位基因的特異性標記，如DNA甲基化和翻譯后組蛋白的修飾.印記基因和印記機制在老鼠和人類之間具有極高的相似性，研究人員已經(jīng)使用實驗小鼠模型和人類遺傳疾病研究進行基因印記領(lǐng)域的探究.印記基因一般位于3-12基因簇，遍布于20 kb-3.7 Mb的DNA，也有實例表明單個印記基因的存在.[1]來自母源和父源的表達印記基因具有調(diào)控編碼蛋白質(zhì)和非編碼RNA的作用.在過去的25年里很多研究一直圍繞著基因的鑒別和印記基因表達的機制展開，這些研究表明，少量表現(xiàn)出印記表達的基因?qū)Σ溉閯游锏纳L發(fā)育有很大的影響.現(xiàn)在，更多的印記基因被發(fā)現(xiàn)并被證實對眾多不同的過程產(chǎn)生影響，包括胎兒生長的多能性、分化和表型.本文旨在綜述印記基因調(diào)控機制和印記基因在不同發(fā)展階段的不同作用，并詳細闡述近期證實其功能重要性的研究.

1　印記基因的發(fā)生、維持和消除機制

1）印記基因的建立.1991年首次證實的印記基因（IGF2R、IGF2和H19）引發(fā)了對于印記建立、印記維持、印記擦除機制的闡釋，這些機制共同控制著基因印記的時間和位置.印記控制區(qū)域的等位基因特異性DNA甲基化，是受精后賦予親本特異性的最合理的解釋.此外，配子形成期母源和父源基因處于分裂期能夠被獨立修飾，在此期間親本基因組能夠被區(qū)分開促使研究者分析其甲基化，這使得親本特異性印記的假說得到加強.它最先表明H19/IGF2印記控制區(qū)域父本特異性甲基化在雄性性原細胞形成到減數(shù)分裂時期之前.[2]相比之下，母源特異性印記控制區(qū)域甲基化發(fā)生在卵母細胞形成之后,在此期間不同的印記控制區(qū)域在不同的時間段內(nèi)發(fā)生不同的甲基化.[3]在這2種生殖細胞中，DNA的甲基化是通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)和輔助蛋白DNMT3L來完成.[4]

2）印記基因的維持.受精后，盡管存在大范圍的基因重組和DNA去甲基化,但此時親本特異性印記必須維持.研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DNMT1在其中起維持作用，DNMT1可以通過甲基化新形成的DNA鏈，在受精后的重新編碼中，可能通過反式作用因子來識別獨特的順式作用序列，為特異性印記提供保護.此外，鋅指蛋白57(ZFP57)在調(diào)節(jié)印記基因中扮演著更特殊的作用.在胚胎早期，有可能是因為其他尚未查明的蛋白在ICR中維持DNA甲基化的作用.

3）印記基因的消除.最后，為完成印記周期，原始生殖細胞(PGCs)雙親的軀體模式印記被擦除.印記丟失包括一系列的主動丟失和被動丟失，涉及10-11易位酶(Tet)家族的甲基胞嘧啶雙加氧酶，它有催化氧化5-甲基胞嘧啶成為5-羥甲基胞嘧啶以及DNA修復(fù)的作用.[5]此外，在原始生殖細胞中，由DNMT1維持的新復(fù)制DNA的甲基化受到抑制，可能與表觀遺傳學因子UHRF1的抑制有關(guān)，UHRF1是招募DNMT1必不可少的一個因子.

2　印記基因調(diào)節(jié)機制研究

2個已知的印記基因調(diào)控機制已被證實：絕緣子模型和ncRNA模型.[6]在絕緣子模型中，母源等位基因ICR未甲基化，被絕緣子蛋白CCCTC結(jié)合因子CTCF阻斷.父源等位基因高甲基化使得CTCF無法結(jié)合，絕緣子無法形成.因此，IGF2基因被下游共享的增強子激活.在這個模型中，ICR表觀遺傳決定了位點的表達模式.另一個主要印記模型是ncRNA模型被運用在許多位點上，包括IGF2R/Airn和Kcnq1/Kcnq1ot1.在這種情況下，長ncRNA的啟動子位于ICR.父源等位基因ICR未甲基化，因此可以允許ncRNA表達，在順式區(qū)域中這反而會使其他基因沉默.這種機制來源可能是通過吸引抑制染色質(zhì)信號的組分或通過阻止RNA聚合酶II在啟動子上集結(jié)來形成.母源等位基因相對基因ICR甲基化導(dǎo)致ncRNA沉默，因此允許近端基因激活.在這種情況下，長ncRNAs的作用是促進相鄰基因的沉默.

2.1　印記基因?qū)ε咛ドL發(fā)育的調(diào)節(jié)

單系老鼠胚胎發(fā)育受限的研究證實印記基因是生長發(fā)育所必須的.在老鼠身上，單系胚胎可以通過受精卵原核細胞核的移植產(chǎn)生，但雄核胚胎(來自2個父源原核)和雌核胚胎(來自2個母源原核)缺乏胚胎及胚胎外的組織，[7]說明印記基因在早期生長具有重要的作用.

關(guān)于印記基因調(diào)節(jié)生長，研究最充分的是父系表達IGF2基因，它是胎兒生長的正調(diào)節(jié)基因，而IGF2雙等位基因不恰當?shù)谋磉_導(dǎo)致胚胎廣泛增生或生長受限，[8]但母源表達的印記基因IGF2R可以使IGF2對胎兒生長的作用無效.IGF2R突變與過度生長和胚胎死亡相關(guān)，但在IGF2失效的情況下這2種表型不會發(fā)生.另一個對于胚胎發(fā)育起到廣泛促進作用的是GRB10，其具有重要的生長調(diào)節(jié)作用，在大多數(shù)小鼠組織中母系表達.和IGF2一樣，GRB10對生長的調(diào)控作用可能是通過胰島素信號通路，結(jié)合胰島素受體和胰島素樣受體IGF1R和IGF2R，且最近的研究也表明，GRB10是哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR的底物，通過mTOR介導(dǎo)的磷酸化和GRB10的穩(wěn)定導(dǎo)致胰島素信號降低.[9]

雖然IGF2、IGF2R、H19和GRB10對調(diào)節(jié)生長、控制通路有重要作用，但還有許多其他印記基因影響胚胎的生長是通過其他機制進行的.研究表明，一些印記基因，包括PEG1（MEST）、GTL2（MEG3）、CDKN1C、PLAGLl1和DLK1，在多種組織中相互協(xié)調(diào)，與IGF2和GRB10在“印記基因網(wǎng)”中共同調(diào)節(jié)生長.[10]轉(zhuǎn)錄因子ZAC1(Plagl1)是父系表達的印記基因，它已被證實在印記基因網(wǎng)中改變其表達，敲除該基因可導(dǎo)致小鼠宮內(nèi)生長受限和新生小鼠死亡.此外ZAC1改變多個印記基因的表達，包括Cdkn1c和Dlk1，它通過結(jié)合其增強子來直接調(diào)節(jié)H19/IGF2.此外，H19集結(jié)MBD1有可能是反式印記基因網(wǎng)的調(diào)控因子.最后，BMI1是核心蛋白復(fù)合體1(PRC1)中的一員，在印記基因網(wǎng)絡(luò)中也與其他印記基因的表達有關(guān).[11]

盡管之前印記基因的研究運用的都是老鼠模型，在胚胎發(fā)育中印記異常導(dǎo)致的多種臨床表型在人類中也是顯而易見的.例如，貝克維斯-威德曼綜合癥（BWS）是一種先天過度生長的疾病，其與第11號染色體上印記基因相鄰簇的基因缺陷有關(guān).貝克維斯-威德曼綜合癥患者一般在出生前就已發(fā)生過度生長，出生之后可能發(fā)生新生兒低血糖，并伴隨有巨舌、內(nèi)臟腫大、半邊肥大等病癥.這種綜合癥大部分是由于KCNQ1OT1基因長ncRNA ICR甲基化的缺失引起的.這種甲基化的缺失導(dǎo)致ncRNA的雙等位基因的表達，而通過KCNQ1OT1的調(diào)節(jié)對蛋白編碼基因產(chǎn)生順勢作用抑制.與BWS表型有關(guān)的蛋白編碼基因CDKN1C，其編碼蛋白質(zhì)充當細胞周期抑制劑和生長調(diào)節(jié)閥，CDKN1C的缺失或突變都會導(dǎo)致過度生長.[12]相比BWS，銀羅素綜合癥（SRS）使嬰兒在胎齡期長得很小，隨后表現(xiàn)出侏儒癥癥狀.SRS與H19/IGF2 ICR低甲基化高度相關(guān)，這導(dǎo)致H19雙等位基因的表達和IGF2雙等位基因的抑制.[13]BWS和SRS都與不對稱生長和各種有害的表型相關(guān)，這表明這些印記基因在與生長相關(guān)的生物進程中具有至關(guān)重要的作用.

2.2　印記基因?qū)Υ竽X與神經(jīng)發(fā)育的影響

印記基因在哺乳動物大腦的發(fā)育過程中同樣具有特別重要和極其復(fù)雜的作用.這在研究單性生殖（PG，類似于雌核胚胎但由受精卵而來）和雄激素細胞（AG，只存在父系）在嵌合胚發(fā)育過程中對神經(jīng)系統(tǒng)的作用中表現(xiàn)得尤為明顯.PG和AG細胞在嵌合體大腦發(fā)育中僅有很少的作用，PG嵌合體具有較大的大腦和較小的身體，而AG嵌合體具有較小的大腦，但更大的身體.此外，PG和AG細胞對于大腦分區(qū)有影響，PG細胞在新皮質(zhì)中更加普遍，而AG細胞在前視區(qū)和下丘腦更為普遍.這表明母源和父源基因組在神經(jīng)元發(fā)育中具有不同的作用，這取決于他們中的許多關(guān)鍵印記基因及其調(diào)節(jié)功能.

許多印記基因在大腦中的表達模式和功能與在其他組織中是不同的.研究最充分的是UBE3A，其在大多數(shù)組織中雙等位基因表達而在某些特定的神經(jīng)元亞型中只有母源性表達.母源UBE3A缺陷導(dǎo)致天使綜合征AS，AS是一種與認知和運動障礙有關(guān)的神經(jīng)發(fā)育障礙性遺傳病.[14]UBE3A是泛素連接酶，它可使靶蛋白降解.在體外培養(yǎng)中，UBE3A已被證明是泛素化蛋白質(zhì)，對細胞周期調(diào)控有重要作用,如P53(TRP53)、HHR23A(RAD23A)和MGMT.[15]UBE3A一種存在于神經(jīng)突觸中的蛋白，同樣被證明可以泛化ARC，其對于神經(jīng)可塑性非常重要的谷氨酸受體內(nèi)在化有促進作用.敲除小鼠UBE3A，大腦凍融物ARC和P53水平提高，這證明了UBE3A在神經(jīng)元中具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)水平的作用.

其他顯示大腦特異性表達模式的印記基因有助于大腦的高復(fù)雜性細胞類型的建立.PEG3是一個父系表達基因，通過與P53和促凋亡因子rBAX的相互作用控制神經(jīng)元中的凋亡.[16]父源PEG3的缺失導(dǎo)致了新生兒特定大腦區(qū)域細胞凋亡的增加.這種凋亡最終使催產(chǎn)素分泌神經(jīng)元總數(shù)減少，掩蓋大腦不同區(qū)域細胞凋亡導(dǎo)致的性別特異性差異，這些區(qū)域涉及性行為，嗅覺和信息處理.另一個影響特異性神經(jīng)元亞型的印記基因是父源表達的NDN基因，它可以編碼一種蛋白質(zhì)使其與P53以及多種生長因子相互作用從而影響神經(jīng)元的分化和生長.[17]NDN突變的小鼠表現(xiàn)出下丘腦神經(jīng)元密度的減少以及在軸突擴展上的形態(tài)異常，此外，大量的下丘腦功能障礙在普拉德-威利綜合征(PWS)上表現(xiàn)很明顯.[18]因此，NDN突變，以及在其他具有相同印記簇的基因，包括SNRPN和核仁小RNAs突變均與PWS有關(guān).

3　印記基因?qū)Ω杉毎淖饔?/h2>

最近發(fā)現(xiàn)印記基因?qū)Ω杉毎哂兄陵P(guān)重要的作用，相關(guān)研究涉及到胚胎干細胞(ESCs)、誘導(dǎo)性多功能干細胞(iPSCs)和成人干細胞.

不管這些細胞將來是否被用于研究基礎(chǔ)發(fā)育過程或人類治療，一個適當?shù)挠∮洏藴适潜夭豢缮俚?印記丟失(LOI)不僅可以導(dǎo)致前面提到的早期生長發(fā)育障礙，而且與細胞轉(zhuǎn)化和癌癥也高度相關(guān).許多印記基因，包括H19、PEG1、PEG3是已知的腫瘤抑制基因.[19]此外，“imprint-free”小鼠ESCs具有完全的LOI，對于嵌合體發(fā)育產(chǎn)生明顯的效果，這些老鼠在一年之后患有多種類型的癌癥.[20]因此,對于iPSCs中印記基因的表達和功能需要仔細研究，這些研究結(jié)果以及對于胚胎干細胞和成體干細胞的印記分析，突出了多功能干細胞群中印記基因功能的重要性.

印記基因與成體干細胞群的維持和功能密切相關(guān).父系PEG3表達轉(zhuǎn)基因報告顯示小鼠成體鼠的PEG3在各種組織中的干細胞群中表達受限，這些組織包括大腦、腸、骨骼、肌肉和皮膚.[21]神經(jīng)球的生成，是通過體外神經(jīng)元分離和擴增技術(shù)形成的，在此過程中導(dǎo)致了約100%的PEG3陽性細胞的生成.此外，表皮移植實驗表明轉(zhuǎn)移PEG3陽性細胞在毛囊干細胞壁龕中具有自我更新和分化能力.這些實驗表明，PEG3在成體干細胞中起著功能性作用，雖然目前尚不清楚這些作用是否與早期發(fā)育中所體現(xiàn)出的作用不同.

在小鼠中，母系表達H19基因與成人造血干細胞（HSC）群的維持也有關(guān).[22]誘導(dǎo)母系HSCs H19/IGF2 ICR刪除，導(dǎo)致H19表達減少和IGF2表達增加，伴隨著造血干細胞數(shù)目長期減少，短期增加，逐漸喪失造血潛能和功能.此外，母系H19/IGF2 ICR的刪除通過增加IGF2表達量和降低IGF1R表達量導(dǎo)致IGF2-IGF1R通路的不適當?shù)募せ?，而IGF1R又是mir-675的靶位點，這導(dǎo)致由FOXO3介導(dǎo)的細胞周期阻滯相關(guān)的靜止受到抑制，最終導(dǎo)致活化以及長期HSCs耗盡.

此外，研究證實小鼠神經(jīng)干細胞（NSCs）及其壁龕選擇性丟失DLK1印跡對于后天神經(jīng)形成至關(guān)重要.[23]DLK1是Notch信號的膜結(jié)合受體，出生后大多數(shù)組Notch信號下調(diào).小鼠DLK1缺陷導(dǎo)致慢區(qū)分神經(jīng)干細胞減少，從而導(dǎo)致成人嗅球神經(jīng)元耗竭.神經(jīng)干細胞和周圍的星形膠質(zhì)細胞從2個等位基因表達DLK1，而DLK1只從父系等位基因表達.DLK1這種協(xié)調(diào)雙等位基因表達凸顯了印記基因調(diào)控環(huán)境特異性的重要性，以及基因劑量對印記基因的重要性.

4　總結(jié)

雖然初期研究表明，印記基因的表達對早期胚胎生長和分化十分關(guān)鍵，特別是基因組印跡對哺乳動物的發(fā)育起著更廣泛的作用.值得注意的是這一評述旨在強調(diào)的只是基因組印記和印記基因的部分功能，并不全面.許多印記基因的各項功能已被記載下來，但對組織特異性印記的理解還不夠充分.對于印記在復(fù)雜的組織如大腦以及成人干細胞中作用的進一步探索無疑將為我們帶來關(guān)于印記基因的表達及其功能的更多發(fā)現(xiàn).

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