劉稱稱 劉 紅 陳天杰 秦 爽 路政寬 黃 山 陳 良

作者單位：130021長春，吉林大學(xué)口腔醫(yī)院·吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（劉紅為通訊作者）

牙周炎伴隨的牙槽骨吸收、拔牙后剩余牙槽嵴萎縮、腭裂、手術(shù)治療等原因引起的頜骨骨量丟失是口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域最常見的臨床表現(xiàn)之一。目前對骨缺損修復(fù)的方法主要有以下幾種：骨或骨替代物移植，化學(xué)藥物，牽張成骨，干細(xì)胞組織工程等[1，2]。有限的自體骨來源、手術(shù)時造成的二次傷害等原因限制了其臨床應(yīng)用；同種異體骨制備及保存復(fù)雜，尤其是其本身的免疫原性及移植后的各種并發(fā)癥也嚴(yán)重影響了其應(yīng)用。應(yīng)用化學(xué)藥物不僅所達(dá)到的骨吸收抑制作用有限，而且因口服或靜脈等全身給藥方式，導(dǎo)致藥物的有效治療濃度維持時間短，需要頻繁大量服藥，而長期應(yīng)用又對胃腸道、腎臟和牙槽骨等造成不同程度的損傷。使用胚胎干細(xì)胞尚存在倫理問題，成體干細(xì)胞需通過手術(shù)獲取，安全性不足、費(fèi)用昂貴及操作復(fù)雜等原因尚未被社會和廣大患者所接受[3]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP-2）是骨缺損修復(fù)領(lǐng)域里研究最多最深入、效果最確切的成骨生長因子[4]。但是單純應(yīng)用BMP蛋白半衰期較短，用量大，而且來源困難。隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)理論與實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)步，應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)治療骨破壞正成為國際上研究的熱點(diǎn)。基因治療通過將成骨基因?qū)爰?xì)胞，不同于重組細(xì)胞因子的爆發(fā)性釋放，可實(shí)現(xiàn)高活性成骨蛋白的持久表達(dá)及釋放[5]。而基因進(jìn)入細(xì)胞需要載體的協(xié)助，本文就對BMP-2基因治療骨缺損中載體的研究進(jìn)行闡述。

一、病毒類載體

病毒類載體是目前應(yīng)用BMP-2基因治療中主要的載體，主要包括慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒等。

1.慢病毒載體

慢病毒載體是指以人類免疫缺陷病毒-1（HIV-1）來源的一種病毒載體，慢病毒載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息，是慢病毒載體系統(tǒng)的主要組成部分[6]。其以轉(zhuǎn)染效率高、可持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)外源基因、增加調(diào)控基因后可調(diào)控目的蛋白的表達(dá)量、容納大片段（8～10kb）的外源性目的基因和安全性高等優(yōu)點(diǎn)，近年來已經(jīng)越來越多的應(yīng)用于骨缺損修復(fù)和再生領(lǐng)域并取得了很好的效果[7]。孫健等[8]的實(shí)驗(yàn)證實(shí)攜帶BMP-2基因的慢病毒載體感染大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）后，BMP-2通路增強(qiáng)了細(xì)胞的黏附能力及相關(guān)成骨分化因子骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、膠原蛋白Ⅰ（Col1）的表達(dá)量，可明顯促進(jìn)大鼠BMSCs向成骨細(xì)胞定向分化。張鎮(zhèn)等[7]通過慢病毒載體成功將BMP-2基因轉(zhuǎn)入第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)堿性磷酸酶（ALP）和茜素紅染色強(qiáng)陽性證實(shí)了誘導(dǎo)成骨活性。Guan等[9]的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶BMP-2基因的慢病毒載體感染人尿源性干細(xì)胞（USCs）后，USCs高表達(dá)BMP-2基因，并且成骨轉(zhuǎn)錄因子-2（Runx2）和OCN也高表達(dá)，組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)這一體系可以促進(jìn)新骨的形成。Lin等[10]以慢病毒（LV）為載體，將BMP-2基因以及綠色熒光蛋白（GFP），即LV-BMP/GFP體系轉(zhuǎn)入體外培養(yǎng)的人BMSCs內(nèi)，此為實(shí)驗(yàn)組，該實(shí)驗(yàn)的對照組為LV-GFP，PCR檢測表明實(shí)驗(yàn)組的成骨標(biāo)記因子高表達(dá)于對照組，聯(lián)合免疫缺陷鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組較對照組有更多的新生骨生成。綜上所述：慢病毒可以作為BMP-2基因治療中一種有效的載體。

2.腺病毒載體

腺病毒（AD）是一種無包膜、具有57種血清型的線性雙鏈DNA病毒，在目前已知的病毒載體中，腺病毒載體是最有效的基因傳遞系統(tǒng)，其裝載基因容量大，可達(dá)37kb；宿主細(xì)胞廣泛；滴度高，短期內(nèi)轉(zhuǎn)染效率高，并且我們已經(jīng)掌握其最安全的劑量[11]。Johannes等[12]通過AD成功將BMP-2基因轉(zhuǎn)入人間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）中，實(shí)驗(yàn)證實(shí)MSCs表達(dá)的BMP-2、OPN、OCN、Runx2量明顯增高。何春耒等[13]發(fā)現(xiàn)攜帶BMP-2的重組腺病毒載體能夠高效轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的兔BMSCs，使得BMSCs能夠高效、持續(xù)表達(dá)、分泌BMP-2蛋白。另外有實(shí)驗(yàn)表明：在高糖環(huán)境下，AD介導(dǎo)的BMP-2可以成功轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，轉(zhuǎn)染后靶細(xì)胞可存活，目的基因正常表達(dá)，表達(dá)量較對照組明顯增加，從而為糖尿病患者骨折難愈合、不愈合在基因治療方面尋找到突破口[14]。Menendez等[15]構(gòu)建馬的骨、軟骨缺損模型，然后將Ad-BMP-2體系直接注射到缺損部位，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其能促進(jìn)骨、軟骨的生成，但是作用時間比較短，無法提供長期的骨軟骨修復(fù)。Wang等[16]以轉(zhuǎn)染了Ad-GFP-hBMP-2的兔BMSCs為實(shí)驗(yàn)組，以未轉(zhuǎn)染組為對照組，研究發(fā)現(xiàn)：在每一個相同的時間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組的ALP活性均較對照組的高，BMP-2基因及表達(dá)量也呈現(xiàn)出相同的趨勢，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組的骨生成量明顯較對照組多。Zhang等[17]將hBMP-2與hVEGF-165雙基因共表達(dá)腺病毒載體轉(zhuǎn)染兔BMSCs，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的BMSCs高表達(dá)BMP-2基因，并且成骨誘導(dǎo)21天后茜素紅染色可證實(shí)有明顯的鈣結(jié)節(jié)的形成。由此可以推論：AD是BMP-2基因治療中有效的載體

3.腺病毒相關(guān)病毒載體

腺病毒相關(guān)病毒（AAV）是一類單鏈線狀DNA缺陷型病毒，其基因組DNA小于5kb，無包膜，外形為裸露的20面體顆粒。AAV不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒、痘苗病毒）存在時，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。和Ad相比，AAV能夠減小致病性、降低抗原性[18]?？陆鸬萚19]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)攜帶BMP-2的AAV-2載體轉(zhuǎn)染兔BMSCs后ALP活性，鈣離子含量以及成骨基因的表達(dá)均顯著上調(diào)；同時，植人轉(zhuǎn)hBMP-2基因的兔BMSCs，實(shí)驗(yàn)組介導(dǎo)了全厚頭骨骨缺損的修復(fù)，由此我們可以得出結(jié)論：AAV攜帶BMP-2基因轉(zhuǎn)染可顯著增強(qiáng)兔BMSCs的成骨能力。Dupont等[20]以AAV為載體，將BMP-2基因植入人BMSCs內(nèi)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)此舉能顯著提高BMSCs的BMP-2蛋白表達(dá)量以及ALP活性，并且通過構(gòu)建動物模型也得出了相同的結(jié)論。王敏等[21]構(gòu)建大鼠牙槽骨缺損模型，實(shí)驗(yàn)組骨缺損區(qū)植入浸有攜目的基因hBMP-2和標(biāo)記GFP的重組腺相關(guān)病毒液（rAAV-hBMP2-GFP）的明膠海綿塊，對照組植入只浸有攜GFP的空病毒液（rAAV-GFP）的明膠海綿塊，結(jié)果表明：兩組樣本牙槽骨缺損處的骨密度值均隨時間的增加而增高，但是在相同的時間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組樣本牙槽骨缺損處骨密度值均高于對照組，這說明AAV載體可以介導(dǎo)BMP-2基因成功修復(fù)大鼠牙槽骨缺損。

病毒載體由于其較高的轉(zhuǎn)染效率是目前應(yīng)用最多的基因載體，但是作為一種改造的病毒，其價格昂貴，難以大規(guī)模生產(chǎn)，且存在安全隱患和免疫原性等問題，因此許多學(xué)者把注意力逐步轉(zhuǎn)向?qū)Ψ遣《据d體的研究。非病毒載體主要包括脂質(zhì)體和陽離子聚合物等[22]。

二、非病毒類載體

1.脂質(zhì)體

脂質(zhì)體是一種人工合成的脂質(zhì)雙分子層球形囊泡，在1964年首次被Bangham和Horne報(bào)導(dǎo)[23]。其是目前最常用的非病毒類載體，它是將DNA包裹在類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成的微型包裹體轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入靶細(xì)胞，質(zhì)粒DNA與陽離子脂質(zhì)體結(jié)合后能夠?qū)⑵潆姾赊D(zhuǎn)變?yōu)檎娦?，從而易于與帶負(fù)電荷的細(xì)胞膜結(jié)合，以增強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)染效率，而且由于脂質(zhì)雙層的包裹，被包封的DNA得到保護(hù)，不易被核酸酶降解[24]。趙銘等[25]利用脂質(zhì)體Lipofectamine TM2000介導(dǎo)hBMP-2基因轉(zhuǎn)染第4代脂肪干細(xì)胞（ADSCs），術(shù)后檢測發(fā)現(xiàn)血清鈣、磷及ALP水平明顯升高，X線檢查可看到有明顯的成骨、骨缺損得到修復(fù)，HE染色可見到大量的成骨細(xì)胞生成。俞莉敏等[26]以BMP-2為目的基因，人BMSCs為載體細(xì)胞，以非病毒載體脂質(zhì)體質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)染人BMSCs，建立可穩(wěn)定表達(dá)BMP-2的有限種子細(xì)胞系。結(jié)果表明：BMP-2基因轉(zhuǎn)染修飾的人BMSCs生長增殖分化等生物學(xué)活性良好，可穩(wěn)定表達(dá)分泌外源轉(zhuǎn)染BMP-2基因，并且實(shí)驗(yàn)組的ALP活性顯著高于對照組。唐宇欣等[27]使用脂質(zhì)體將BMP-2基因轉(zhuǎn)染取自同一只SD大鼠的BMSCs和ADSCs中，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：BMSCs和ADSCs組的BMP-2基因表達(dá)均升高，并且Runx2、Col1、ALP等成骨基因的表達(dá)均上調(diào)，茜素紅染色結(jié)果顯示：鈣結(jié)節(jié)量明顯增多。這說明脂質(zhì)體是BMP-2基因治療中一種可靠的載體。

2.陽離子聚合物

陽離子聚合物也具有良好的DNA結(jié)合和保護(hù)能力，同時還具有良好的生物相容性、低毒性及易于化學(xué)修飾以改進(jìn)其靶向性等優(yōu)點(diǎn)，成為基因載體研究中的新方向。目前作為基因載體常用的陽離子聚合物包括：聚賴氨酸（poly-L-lysine，PLL），聚乙烯亞胺（PEI），聚丙烯亞胺樹狀物（polypropylenimine，PPI）， 聚 酰 胺 - 胺 型 樹 狀 物（polyamidoamine，PAMAM），殼聚糖等，其中PEI是目前最有效也是研究最多的非病毒基因載體。下面主要對PEI在BMP-2基因治療中的作用進(jìn)行闡述。Lü等[28]利用PEI衍生物GenEscortTMII為載體，介導(dǎo)BMP-2基因轉(zhuǎn)染犬BMSCs，體外研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染組的ALP活性、BMP-2基因、Runx-2、OPN基因表達(dá)量較非轉(zhuǎn)染組明顯增高，并且裸鼠動物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)較對照組相比，實(shí)驗(yàn)組有更多的新生骨量。由于PEI帶有大量正電荷，使其具有較高的細(xì)胞毒性，所以Jin等[29]利用帶有負(fù)電的海藻酸鹽與PEI通過靜電力相互作用形成復(fù)合物PEI-al，中和PEI過多的正電荷，從而降低其毒性，MC3T3-E1細(xì)胞轉(zhuǎn)染PEI-al/pBMP-2復(fù)合物后主要的成骨標(biāo)記物Col1、絲氨酸蛋白酶7（SP7）、Runx2、ALP的表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，說明BMP-2的表達(dá)能夠促進(jìn)MC3T3-E1向成熟的成骨細(xì)胞分化；茜素紅染色的結(jié)果也表明轉(zhuǎn)染BMP-2基因后MC3T3-E1細(xì)胞分泌和促骨基質(zhì)礦化的能力也明顯提高了，并且將基因修飾的細(xì)胞植入大鼠的顱骨缺損后發(fā)現(xiàn)PEI-al/pBMP-2復(fù)合物具有一定促進(jìn)大鼠顱蓋骨缺損修復(fù)的作用。綜上：PEI是BMP-2基因治療中一種可靠的載體。

非病毒類載體具有低毒、低免疫反應(yīng)、可反復(fù)應(yīng)用等優(yōu)點(diǎn)，但也有靶向性差、難通過細(xì)胞屏障、基因轉(zhuǎn)染效率低、不能長期表達(dá)及表達(dá)不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。由于以上轉(zhuǎn)染方法存在的缺點(diǎn)，人們一直在尋找一種更加有效的轉(zhuǎn)染技術(shù)，即物理方法類轉(zhuǎn)染技術(shù)。其主要包括基因槍法、電穿孔法以及超聲法。

三、物理方法類載體

1.基因槍法

1987年，Sanford，Klein等人首創(chuàng)一套火藥驅(qū)動的基因?qū)朐O(shè)備，一次可以將目的基因?qū)霐?shù)以千計(jì)的細(xì)胞[30]。最初他們使用該設(shè)備直接將包裹在鎢粒表面的外源RNA或DNA導(dǎo)入大蒜表皮獲得了瞬時表達(dá)，這標(biāo)志著基因槍原理上的成功?；驑尲夹g(shù)，又被稱為生物彈道技術(shù)或微粒轟擊技術(shù)，其基本原理就是將外源基因包裹到比重大而化學(xué)性質(zhì)很穩(wěn)定的微米級的金或鎢上，然后用微粒加速裝置打入靶細(xì)胞或組織。Li等[31]構(gòu)建新西蘭大白兔橈骨缺損模型，新鮮骨缺損于截骨后立即使用基因槍進(jìn)行BMP-2基因局部轉(zhuǎn)染，對照組截骨后自然愈合，實(shí)驗(yàn)觀察：治療組骨痂形成數(shù)量普遍多于對照組，Lane-sandhu X線評分和骨結(jié)合率治療組優(yōu)于對照組，并且通過Western-blot和RT-PCR檢測證實(shí)治療組骨缺損周圍的BMP-2含量明顯多于對照組。由此可以看出應(yīng)用基因槍介導(dǎo)BMP-2基因局部轉(zhuǎn)移治療新鮮骨缺損效果明確。朱小萌等[32]也通過構(gòu)建相同的動物模型證明了基因槍介導(dǎo)BMP-2治療陳舊性骨缺損效果明確。

2.電穿孔法

物理法目前研究應(yīng)用較多的為電穿孔法，電穿孔法系指使用高強(qiáng)度的電子場導(dǎo)致暫時性的細(xì)胞膜孔開放，由此促使外源性的DNA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部。Kawai等[33]為了用非手術(shù)方法解決牙槽骨缺損這一難題，用電穿孔方法在大鼠上頜的第一磨牙牙周組織中導(dǎo)入了BMP-2基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在目標(biāo)區(qū)域發(fā)現(xiàn)了外源BMP-2基因，基因?qū)?天后就觀察到新生牙槽骨，7天后可觀察到新生牙槽骨與原有骨組織發(fā)生骨連接。Ferreira等[34]通過電穿孔法將BMP-2基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs，RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞BMP-2 mRNA的表達(dá)量明顯增高，Elisa檢測發(fā)現(xiàn)：BMP-2蛋白表達(dá)量也呈現(xiàn)明顯增高趨勢，，并且轉(zhuǎn)染組ALP活性也明顯增強(qiáng)。這說明利用電穿孔法可以將BMP-2基因有效的轉(zhuǎn)染BMSCs，且轉(zhuǎn)染結(jié)果穩(wěn)定。此法體外應(yīng)用效果較好，但其所需的高強(qiáng)度電流對組織的明顯損害，限制了其在活體組織的應(yīng)用。

3.超聲法

Sun等[35]采用超聲微泡破裂法將含增強(qiáng)型GFP的重組BMP-2質(zhì)粒進(jìn)行小鼠后肢骨骼肌體內(nèi)轉(zhuǎn)染，同時設(shè)定相應(yīng)對照組，觀察其表達(dá)情況，而后進(jìn)行熒光顯微鏡下計(jì)數(shù)、免疫組化檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒注射后7天，A組（單純質(zhì)粒組30μl）和B組（質(zhì)粒+微泡+超聲組30μl）兩組在熒光顯微鏡下均觀察到GFP表達(dá)，但B組陽性肌纖維百分率高于A組，提示超聲介導(dǎo)微泡法能提高基因轉(zhuǎn)染率。14天后，免疫組化結(jié)果分析顯示BMP-2表達(dá)量D組（質(zhì)粒+微泡+超聲組100μl）多于C組（單純質(zhì)粒組100μl）表達(dá)量，同樣證明超聲介導(dǎo)微泡破裂法能增加外源性基因轉(zhuǎn)化率和表達(dá)水平。

以上對BMP-2基因治療骨缺損中載體的研究進(jìn)行了闡述，每種載體都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，相信隨著研究深入以及載體改性技術(shù)的發(fā)展，性能更加優(yōu)異的載體會在骨修復(fù)的基因治療領(lǐng)域發(fā)揮更好的作用，這樣基因治療骨缺損才能產(chǎn)生令醫(yī)患雙方都滿意的治療結(jié)果，相信在不久的將來，基因治療將會成為骨科疾病治療方法中最為有效和經(jīng)濟(jì)的治療手段之一。