程亞楠 徐 普

珍珠層是位于雙殼類、腹足類與頭足類等軟體動(dòng)物貝殼的內(nèi)層部分，來(lái)源廣泛，由有機(jī)基質(zhì)與碳酸鈣耦合構(gòu)成。體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)珍珠層具有骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性、生物相容性和生物降解性。憑借其有競(jìng)爭(zhēng)力的價(jià)格成本、化學(xué)復(fù)雜性及出色的機(jī)械性能等特性，珍珠層被視為一種可以用作骨移植替代物的天然生物材料。本文系統(tǒng)回顧近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于珍珠層研究的體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)，以及珍珠層作為骨移植替代物的潛在作用。

一、珍珠層

1.物理結(jié)構(gòu)：生物組織具有直接影響其力學(xué)性能的復(fù)雜納米、微米尺度結(jié)構(gòu)。在微觀尺度上，珍珠層是由六方晶系文石板片通過(guò)層間有機(jī)基質(zhì)排列而成的連續(xù)平行的薄片組成，其典型結(jié)構(gòu)是一種規(guī)則的“磚墻結(jié)構(gòu)”；在納米尺度上，文石板片本身是由六方晶系的文石結(jié)晶顆粒及覆蓋并嵌入其中的有機(jī)基質(zhì)顆粒組成的復(fù)合材料[1～3]。珍珠層由于獨(dú)特的層狀微結(jié)構(gòu)與構(gòu)成特點(diǎn)表現(xiàn)出比骨更優(yōu)異的抗壓性能。珍珠層的楊氏模量為30～40GPa，而骨的楊氏模量為20GPa，珍珠層與骨的耐撓屈破壞性值分別為 185～200MPa 和 140MPa[4，5]。

2.化學(xué)成分：珍珠層無(wú)機(jī)成分（占珍珠層總質(zhì)量的97%）由文石型碳酸鈣組成，有機(jī)部分（占珍珠層總質(zhì)量的3%）是由蛋白質(zhì)、多肽、糖蛋白、殼多糖等組成的混合物[6]。迄今為止，來(lái)自珍珠層的50多種蛋白質(zhì)和50種多肽已經(jīng)被鑒定（UniProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)），珍珠層內(nèi)的有機(jī)分子可用水和有機(jī)溶劑萃取[7，8]。

二、對(duì)骨移植替代物的臨床要求

骨移植主要有三種類型：自體骨、同種異體骨和骨移植替代物。自體骨移植和同種異體骨移植存在手術(shù)時(shí)間延長(zhǎng)、個(gè)性化塑形困難與疾病傳播等缺點(diǎn)，使其應(yīng)用受到極大限制[9，10]。因此，對(duì)骨移植研究的重點(diǎn)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)各種骨移植替代物的研究[11]。由于創(chuàng)傷、感染與腫瘤等導(dǎo)致的不同部位的骨丟失應(yīng)該有不同的處理方法。臨床上選擇骨移植替代物主要取決于以下因素[12]：缺損大小與骨移植物需求量；預(yù)期臨床應(yīng)用效果；生物力學(xué)性質(zhì)；化學(xué)組成；理想的生物活性（骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性、成骨能力）；理想的降解率；處理特性；相關(guān)的副作用；成本與倫理等問(wèn)題。

迄今為止，還沒(méi)有一種理想的骨移植替代物，能夠滿足所有臨床需求。為了滿足骨移植替代物的主要要求，引入了4Fs法則，即形態(tài)、功能、固定和形成[11]。形態(tài)意味著骨缺損腔能夠被骨移植替代物所填充；功能是指骨移植替代物的承重性能；固定是需要移植材料牢固地附著在骨缺損邊緣，消除宿主骨和材料之間的動(dòng)度，以避免不連接或形成假性關(guān)節(jié)；形成是指移植材料能夠促進(jìn)骨形成。對(duì)于骨移植替代物，顱外科手術(shù)則有更多關(guān)于形態(tài)的要求；而矯形外科手術(shù)，特別是有嚴(yán)重骨折或肢體重建的情況，對(duì)功能和固定要求更高；此外，口腔頜面外科與牙科手術(shù)對(duì)移植物也有不同的要求。

三、目前骨移植替代物研究的主流思路和主要困境

目前合成骨移植替代物研究的重點(diǎn)旨在改善其潛在的成骨性、骨傳導(dǎo)性和骨誘導(dǎo)性。成骨性（骨生成）意味著骨移植替代物本身含有骨形成細(xì)胞，能夠形成骨基質(zhì)。骨傳導(dǎo)性是指移植物可以引導(dǎo)前體成骨細(xì)胞及骨細(xì)胞在其表面或其內(nèi)部的孔隙與管道中生長(zhǎng)[13]。骨誘導(dǎo)性是指可以從周圍的組織募集未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞并刺激這些細(xì)胞發(fā)育成為具有骨再生能力的前成骨細(xì)胞，分泌骨基質(zhì)形成新骨[13，14]。

盡管在過(guò)去20年中，已經(jīng)發(fā)表了超過(guò)21000篇關(guān)于骨移植替代物的報(bào)道，但是由于一些無(wú)法規(guī)避的限制與挑戰(zhàn)，骨移植替代物并沒(méi)有全部應(yīng)用于臨床實(shí)踐[11，12，15～17]。目前骨移植替代物發(fā)展面臨的最難解決的問(wèn)題是：①制備高機(jī)械強(qiáng)度的多孔支架并保持適當(dāng)?shù)难芑退拗髡闲再|(zhì)；②評(píng)估大型負(fù)重動(dòng)物模型中的移植功能；③調(diào)整宿主異物反應(yīng)；④評(píng)估制造過(guò)程的技術(shù)難點(diǎn)、效率、成本和植入前期的安全風(fēng)險(xiǎn)；⑤滿足特定的市場(chǎng)需求。

四、關(guān)于珍珠層的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)

Lopez等人在1992年發(fā)現(xiàn)珍珠層同時(shí)具有生物相容性和骨誘導(dǎo)性[18]。隨后，針對(duì)珍珠層的成骨特性，國(guó)內(nèi)外科研工作者們開(kāi)展了大量廣泛而深入的研究。在過(guò)去的20年中，珍珠層被設(shè)計(jì)的更加巧妙，并進(jìn)行了在各種不同植入部位與不同用途的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，植入部位涉及上頜骨、下頜骨、股骨等[19～23]。在人類、大鼠、羊、兔和豬的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均觀察到由珍珠層誘導(dǎo)的新骨形成[19，20，24～26]。

1.珍珠層的生物相容性、骨傳導(dǎo)性、骨誘導(dǎo)性與骨結(jié)合：Atlan等[19]將珍珠層粉與自體血的混合物分別注射到8名女性患者的上頜前磨牙區(qū)骨缺損部位，術(shù)后6個(gè)月的活檢結(jié)果顯示珍珠層耐受良好，與新生骨組織形成緊密結(jié)合，沒(méi)有任何軟組織或纖維組織的干預(yù)，珍珠層粉逐漸向心性生物溶解，并被未成熟的編織骨取代，然后改建為成熟的板層骨，該研究結(jié)果表明珍珠層具有良好的生物相容性和成骨特性，隨后的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了Atlan等的研究成果[27，23]。

2.珍珠層與其他骨移植材料之間的比較：Asvanund等[20]通過(guò)外科程序在10只雄性豚鼠雙側(cè)下頜骨制備骨缺損，其中8只豚鼠骨缺損區(qū)分別植入棒狀珍珠層（2×2mm）與β-磷酸三鈣顆粒（β-TCP），另外2只豚鼠進(jìn)行假手術(shù)處理，術(shù)后30、60d的下頜骨脫鈣組織切片azan染色顯示：骨缺損區(qū)填充材料有助于牙槽骨再生，而珍珠層組相較于β-TCP組與假手術(shù)組顯示出更大量的新骨形成，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)在β-TCP組和假手術(shù)組的下頜骨缺損部位的中心區(qū)域有一些纖維組織填充空間，他們的研究結(jié)果表明了珍珠層用作骨移植替代材料的可行性。Lamghari等[23，27，28]也進(jìn)行了珍珠層粉和聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）在羊椎骨中的比較，在羊腰椎中制備實(shí)驗(yàn)腔，分別填充可注射型珍珠層粉、PMMA和脂肪組織（對(duì)照組），分別于術(shù)后1、8、12w取材制備椎骨切片行組織學(xué)和形態(tài)學(xué)測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：對(duì)照組與PMMA組均無(wú)新骨形成，而在珍珠層粉組，可以觀察到在尚未完全降解的珍珠層粉周圍存在由不同成熟階段的編織狀骨和層狀骨構(gòu)成的骨層，證實(shí)了早期研究結(jié)果[19]。Lamghari等[26]進(jìn)行了珍珠層與自體骨移植物在兔腰椎橫突間融合模型中的成骨作用實(shí)驗(yàn)研究，分別使用珍珠層粉與自體血的混合物及自體髂嵴骨進(jìn)行關(guān)節(jié)固定術(shù)，對(duì)照為假手術(shù)組。術(shù)后2w顯示珍珠層耐受性良好；術(shù)后5w觀察到在珍珠層顆粒降解的區(qū)域內(nèi)有軟骨內(nèi)成骨；術(shù)后11w組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)在珍珠層與自體骨植入的部位仍存在新骨形成，而在假手術(shù)組，無(wú)新骨形成。

3.珍珠層的生物降解性：材料自身的生物降解機(jī)制是選擇植入材料的一個(gè)重要參考因素[24]。珍珠層植入物的形狀與植入位置是影響其降解性的兩個(gè)重要因素。當(dāng)珍珠層以片狀形式植入時(shí)，在術(shù)后10個(gè)月仍能觀察到珍珠層的存在，在骨/珍珠層界面沒(méi)有觀察到破骨細(xì)胞或骨吸收[23，29，30]。將珍珠層加工成粉末狀（粉末粒度為50～150um）植入到兔椎骨中，術(shù)后8w顯示珍珠層粉逐漸降解[19]，沒(méi)有觀察到多核巨細(xì)胞或巨噬細(xì)胞[31]。以上研究結(jié)果在人類上頜骨、大鼠股骨的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)[19，24]。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明珍珠層的降解過(guò)程破骨細(xì)胞并未參與，可能更多的是物理化學(xué)溶解[24]，但是在上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)總是觀察到一些珍珠層粉殘留。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，珍珠層/骨表面的變化速度還取決于骨內(nèi)植入部位與珍珠層/骨相互作用[32]，分別在術(shù)后3、6和9個(gè)月分析骨/珍珠層與骨髓/珍珠層界面，結(jié)果顯示，面對(duì)骨髓的珍珠層表面總是比植入礦化骨部位時(shí)更不規(guī)則，珍珠層界面的變化似乎是植入位置依賴性的而不是時(shí)間相關(guān)性的?？傊?，珍珠層的體內(nèi)生物降解取決于植入物的大小、形狀與植入部位，是一個(gè)高度可變的參數(shù)。珍珠層塊生物降解有限，在骨再生與骨重塑期間會(huì)持續(xù)存在，而粉末狀珍珠層降解速度較快，若珍珠層粉顆粒足夠精細(xì)，可以在短時(shí)間內(nèi)完全降解。

五、關(guān)于珍珠層的體外實(shí)驗(yàn)

由于珍珠層在體內(nèi)具有骨誘導(dǎo)作用，顯示了作為骨移植替代物所該具有的諸多優(yōu)秀品質(zhì)，所以體外實(shí)驗(yàn)的研究重點(diǎn)是明確其成骨機(jī)制及在成骨過(guò)程中發(fā)揮作用的信號(hào)因子。

1.珍珠層復(fù)合物與成骨作用相關(guān)的成分：在沒(méi)有任何化學(xué)誘導(dǎo)劑添加的情況下，珍珠層可以誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞體外礦化，且珍珠層片周圍的成骨細(xì)胞會(huì)優(yōu)先礦化，表明珍珠層具有生物相容性、骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性[18]。其他學(xué)者也進(jìn)行了相似的研究[33，34]。Silve等評(píng)估了骨和珍珠層同時(shí)存在時(shí)對(duì)人成骨細(xì)胞的影響，結(jié)果表明珍珠層對(duì)成骨細(xì)胞有明顯的促成骨作用，通過(guò)現(xiàn)有骨的生長(zhǎng)以及鄰近植入物基質(zhì)內(nèi)形成礦化結(jié)節(jié)發(fā)生新骨形成[33]，體內(nèi)研究中觀察到的結(jié)果也證實(shí)了這種現(xiàn)象[19]。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，珍珠層中的確含有信號(hào)因子，當(dāng)把它放置在培養(yǎng)基時(shí)這些信號(hào)因子會(huì)釋放出來(lái)。這些信號(hào)因子可能存在于珍珠層水溶性基質(zhì)（water soluble matrix，WSM）中，WSM能夠增加前成骨細(xì)胞骨分化標(biāo)記物—堿性磷酸酶、膠原蛋白I與骨鈣素的表達(dá)量，還能夠誘導(dǎo)骨礦化結(jié)節(jié)的形成[34，35]。有學(xué)者認(rèn)為從WSM內(nèi)提取的p10、p60和PFMG3蛋白可以誘導(dǎo)小鼠前成骨細(xì)胞分化[36～38]，也有學(xué)者認(rèn)為在成骨細(xì)胞分化中發(fā)揮作用的珍珠層分子可能更多的與多肽有關(guān)[39，40]。最近有學(xué)者提出珍珠層醇溶性基質(zhì)在MC3T3-E1細(xì)胞和人類骨關(guān)節(jié)炎成骨細(xì)胞中具有類似的骨誘導(dǎo)作用[8，41]。

2.珍珠層的生物降解性：有學(xué)者認(rèn)為珍珠層可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體分化為能夠吸收珍珠層的破骨細(xì)胞，但是珍珠層的吸收效率始終低于骨，并且吸收時(shí)間似乎是有限的[42]。而其他學(xué)者認(rèn)為珍珠層的體外降解與WSM通過(guò)阻止上調(diào)活化T細(xì)胞胞質(zhì)的核因子1（NFATc1）抑制破骨細(xì)胞形成有關(guān)[43]。因此，珍珠層由破骨細(xì)胞介導(dǎo)的體外降解是有限的。

六、結(jié)論與展望

現(xiàn)有的研究結(jié)果表明珍珠層可以加工成不同的形狀用于[44]：①承重部位的骨缺損區(qū)以提供機(jī)械支撐，例如主要長(zhǎng)骨和顎骨缺陷處；②填充無(wú)負(fù)荷部位的大面積骨缺損，例如顱骨缺損；③當(dāng)采取開(kāi)放性解剖術(shù)時(shí)，珍珠層也可用于促進(jìn)椎間融合。珍珠層還可作為注射型材料用于某些微創(chuàng)手術(shù)，注射型珍珠層粉可能比珍珠層片或珍珠層塊有更好的市場(chǎng)前景，用于填補(bǔ)由囊腫或良性腫瘤引起的半封閉性骨缺損。也可以將珍珠層添加到其他移植材料中用以提高材料的骨誘導(dǎo)性和骨傳導(dǎo)性。此外，可以利用3D打印技術(shù)將珍珠層粉和/或其他原料制作成個(gè)性化的植入物用于骨缺損區(qū)[45]。珍珠層提取物也可以用作不同骨移植替代物的表面涂層材料，通過(guò)刺激成骨細(xì)胞活化、抑制破骨細(xì)胞活性來(lái)提高骨誘導(dǎo)能力[46]。到目前為止，似乎沒(méi)有一種完美的骨修復(fù)材料，珍珠層作為一種天然海洋生物材料，具有低成本、低免疫原性、低細(xì)胞毒性、潛在生物學(xué)功能、易于安全儲(chǔ)存等諸多優(yōu)點(diǎn)[47]，有望成為一種理想的骨移植替代材料。

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