程 成，舒鵬程，彭小忠*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)八年制； 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室； 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心， 北京 100005)

近年來(lái)，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)及醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域，包括基因表達(dá)與表觀遺傳學(xué)調(diào)控，遺傳物質(zhì)的動(dòng)態(tài)可視化，模型動(dòng)物的建立，基因療法的探索等。在gRNA引導(dǎo)下，Cas9核酸酶靶向特定DNA序列并誘發(fā)DNA雙鏈斷裂(double strand break, DSB)。DSB可由兩種內(nèi)源性的修復(fù)機(jī)制修復(fù)，易于出錯(cuò)的非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)和同源重組介導(dǎo)的修復(fù)(homology-directed repair, HDR)，從而實(shí)現(xiàn)基因敲除、敲入和染色體轉(zhuǎn)位等編輯[1]。

在CRISPR/Cas9用于基因編輯之前，已有大量研究表明鋅指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFNs)和轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALENs)可靶向特異的DNA。它們均需依賴蛋白-DNA識(shí)別，因此每次實(shí)驗(yàn)都需要根據(jù)靶點(diǎn)構(gòu)建不同的蛋白[2]。而依賴RNA-DNA識(shí)別的Cas9，僅需對(duì)gRNA進(jìn)行設(shè)計(jì)，簡(jiǎn)化了操作流程，為其在生物學(xué)各領(lǐng)域的應(yīng)用提供了技術(shù)條件。本綜述將簡(jiǎn)要介紹CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因編輯原理以及近年來(lái)技術(shù)改進(jìn)。

1 CRISPR/Cas9基因編輯原理

CRISPR/Cas系統(tǒng)來(lái)源于細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可監(jiān)測(cè)并降解從噬菌體和質(zhì)粒入侵的DNA[3]。該系統(tǒng)分為1、2兩大類。其中，2類只需單一的效應(yīng)蛋白，更易于進(jìn)行體外設(shè)計(jì)和改造。效應(yīng)蛋白為Cas9的Ⅱ型是2類系統(tǒng)中最早發(fā)現(xiàn)的，目前基因編輯中最常用的也是Ⅱ型的化膿性鏈球菌Cas9核酸酶 (streptococcuspyogenesCas9, SpCas9)。

當(dāng)外源DNA入侵細(xì)菌時(shí)，Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)首先將入侵DNA整合入CRISPR重復(fù)序列之間。隨后，重復(fù)序列的轉(zhuǎn)錄本被加工為CRISPR RNA(crRNA)，每條crRNA都包含一段由入侵DNA轉(zhuǎn)錄而來(lái)的前間隔序列。接著，反式激活crRNA(transactivating CRISPR RNA, tracrRNA)與crRNA結(jié)合，介導(dǎo)其成熟，并與Cas9酶形成復(fù)合物。crRNA的前間隔序列與入侵DNA堿基配對(duì)，前提是入侵DNA中與crRNA序列相同的鏈在下游緊挨前間隔序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM)。最后，Cas9依賴其HNH和RuvC樣結(jié)構(gòu)域在PAM上游3 nt的位點(diǎn)誘發(fā)入侵DNA的DSB。其中，HNH剪切與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的DNA鏈，RuvC則剪切入侵DNA的另一條鏈[4]。

直至2013年研究者對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行簡(jiǎn)化，首次將CRISPR/Cas9運(yùn)用于真核細(xì)胞的高效基因編輯。研究中，tracrRNA: crRNA二重體被改造為單一的引導(dǎo)RNA (single guide RNA, sgRNA)，其5’端20 nt的序列通過(guò)堿基對(duì)互補(bǔ)來(lái)靶向DNA位點(diǎn)。Cas9在該位點(diǎn)誘導(dǎo)DSB，并由NHEJ或HDR介導(dǎo)無(wú)義突變或基因敲入[5]。

2 CRISPR/Cas9技術(shù)改進(jìn)

CRISPR/Cas9在基因編輯上已有諸多應(yīng)用，但在實(shí)際操作中，脫靶效應(yīng)和編輯效率依然是影響其編輯效果的兩大主要因素。目前已有諸多研究針對(duì)上述問(wèn)題對(duì)該系統(tǒng)加以改進(jìn)，以實(shí)現(xiàn)更可靠高效的編輯。其中主要進(jìn)展如下。

2.1 降低脫靶率，提高靶向特異性

各類CRISPR/Cas9系統(tǒng)均可作用于目標(biāo)位點(diǎn)以外的脫靶位點(diǎn)，產(chǎn)生DSB并引起插入缺失及轉(zhuǎn)位，即脫靶效應(yīng)。脫靶效應(yīng)對(duì)目標(biāo)位點(diǎn)的編輯效率及基因編輯過(guò)程的安全性具有不可忽視的影響。近年來(lái)，研究者從影響靶向精確性的各方面入手對(duì)CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行了改進(jìn)，以期盡可能降低脫靶率。

2.1.1 改變gRNA或PAM序列的長(zhǎng)度：Cas9剪切的特異性受gRNA和PAM的影響。適當(dāng)縮短gRNA中互補(bǔ)區(qū)的長(zhǎng)度可降低脫靶率[6]。而另一項(xiàng)研究中，利用PAM序列更長(zhǎng)的嗜熱鏈球菌Cas9(streptococcusthermophilusCas9, StCas9)對(duì)人類PRKDC和CARD11基因位點(diǎn)進(jìn)行編輯，發(fā)現(xiàn)其脫靶率顯著低于SpCas9[7]。上述兩種策略均能在不影響剪切活性的同時(shí)降低脫靶效應(yīng)，并且不同的PAM序列也擴(kuò)展了該體系靶標(biāo)的范圍。

2.1.2 改變Cas9蛋白構(gòu)象：除了PAM序列和sgRNA，Cas9的HNH結(jié)構(gòu)域構(gòu)象狀態(tài)也可直接調(diào)控剪切活性，從而影響與脫靶位點(diǎn)結(jié)合的能力。通過(guò)突變SpCas9中帶正電的特定氨基酸殘基，使其轉(zhuǎn)變?yōu)殡娭行裕上魅跗渑c非目標(biāo)鏈的互補(bǔ)作用，從而減少脫靶效應(yīng)，甚至可以在某些情況下使脫靶率降低至檢測(cè)不到的水平[8]。此外，將鋅指DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合到CRISPR/Cas9系統(tǒng)可添加額外的校對(duì)步驟，也可明顯改善靶向精確性[9]。

2.1.3 采用配對(duì)切口酶：Cas9切口酶(Cas9 nickase, Cas9n)是Cas9缺失一部分酶切活性的突變體，如RuvC失活的SpCas9 D10A突變體，HNH失活的N863A突變體[10]。單一的Cas9n只能誘導(dǎo)DNA單鏈缺口，且該缺口在真核細(xì)胞中常以高保真的方式修復(fù)。因此，只有成對(duì)的Cas9n，在兩條不同的gRNA引導(dǎo)下才可誘導(dǎo)DSB，雙sgRNA的識(shí)別使編輯準(zhǔn)確性也大大提高。

相似的策略還有由dCas9和FokI核酸酶融合而成的fCas9。在兩條gRNA的引導(dǎo)下，成對(duì)的FokI結(jié)合在DNA上距離較近(約15～25 bp)的位置，形成二聚體并激活其核酸酶活性，從而誘導(dǎo)DSB。研究表明，與野生型Cas9相比，該策略可在提高基因編輯特異性的同時(shí)實(shí)現(xiàn)與配對(duì)切口酶相近的效率[11]。

2.1.4 完善脫靶檢測(cè)方法：提高特異性的前提是具備準(zhǔn)確高效的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法。目前檢驗(yàn)脫靶位點(diǎn)的策略可分為兩大類，一是依賴生物信息學(xué)算法預(yù)測(cè)脫靶位點(diǎn)的有偏方法，二是直接檢測(cè)全基因組內(nèi)所有DSB的無(wú)偏方法[12]。相比之下，無(wú)偏法檢測(cè)更加全面，而有偏法對(duì)于特定脫靶位點(diǎn)的檢測(cè)更加靈敏，因而將兩者結(jié)合將有助于優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，提升對(duì)脫靶位點(diǎn)的檢測(cè)能力。此外，近年有報(bào)道表明，多重酶消化基因組測(cè)序工具(multiplex digested genome sequencing, multiplex Digenome-seq)可在體外同時(shí)繪制多種CRISPR/Cas9核酸酶的全基因組特異性，發(fā)現(xiàn)上百種潛在的突變位點(diǎn)[13]。該法具有高效、簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，為脫靶效應(yīng)的檢測(cè)提供了新的思路。

2.2 提高編輯效率

Cas9編輯效率的提高是其發(fā)展中的另一重要問(wèn)題，尤其在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)及臨床相關(guān)應(yīng)用中，高效的編輯使實(shí)驗(yàn)有更高的可能性達(dá)到預(yù)期效果。改善遞送系統(tǒng)及選用合適的編輯策略可使編輯效率提高。

2.2.1 改善遞送系統(tǒng)：通過(guò)使用合適的載體提升遞送效率是提高編輯效率的一種策略。腺病毒因其自身基因組很少整合入宿主基因組，且適用于多種細(xì)胞類型，在CRISPR/Cas9的在體遞送中有良好的效果。由此改造而來(lái)的腺相關(guān)病毒(adeno-associated virus, AAV)能夠轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂及非分裂細(xì)胞，具有激活細(xì)胞DNA修復(fù)通路并促進(jìn)基因靶向的能力，在編輯效率的提高上也極具潛力[14]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，各種非病毒載體也應(yīng)運(yùn)而生。有研究表明可降解聚合物微粒在遞送CRISPR-Cas9時(shí)具有比商業(yè)脂質(zhì)體更高的轉(zhuǎn)染效率[15]。此外，可生物降解的脂樣物質(zhì)在體外和體內(nèi)均可高效遞送Cas9 mRNA[16]。

除了遞送的載體，遞送系統(tǒng)的構(gòu)成也十分重要。最初的DNA系統(tǒng)存在整合入宿主基因的風(fēng)險(xiǎn)且效率有限，而Cas9 mRNA的遞送技術(shù)尚未完全成熟。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究使用Cas9蛋白與gRNA重組構(gòu)成的核糖核酸蛋白復(fù)合體進(jìn)行體內(nèi)遞送，可在降低脫靶率的同時(shí)提高同源重組修復(fù)[17]。

2.2.2 改善DSB修復(fù)策略：目前大部分研究中采取的是HDR修復(fù)DSB的策略進(jìn)行基因編輯。然而，細(xì)胞內(nèi)尚存與HDR競(jìng)爭(zhēng)的NHEJ修復(fù)途徑，且在分裂及非分裂細(xì)胞中均存在。基于此原理，若能抑制NHEJ的活性則可相對(duì)提高HDR的效率，有望提高基因編輯的效率。有研究證實(shí)使用Scr7這種DNA連接酶IV抑制劑抑制NHEJ活性，可有效提升大鼠中基因編輯的效率[18]。

此外，利用NHEJ在多種細(xì)胞內(nèi)高活性的特點(diǎn)，近期有研究通過(guò)適當(dāng)改造基因編輯中的供體質(zhì)粒，使NHEJ也可在CRISPR/Cas9系統(tǒng)的介導(dǎo)下在人類細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高效的基因敲入[19]?；贜HEJ，近期有研究設(shè)計(jì)出非同源依賴的靶向整合(homology-independent targeted integration, HITI)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了高效的基因編輯，并使視網(wǎng)膜退化大鼠恢復(fù)了部分視力[20]。由于NHEJ在細(xì)胞全周期均處于高活性，因而在分裂和未分裂的細(xì)胞，體外和體內(nèi)均能進(jìn)行高效的基因編輯。新的策略為編輯效率的提高拓展了可能性，同時(shí)也彌補(bǔ)了HDR的局限性，如在不具備分裂能力的神經(jīng)元及心肌細(xì)胞中的應(yīng)用。

2.3 Cas9活性的時(shí)空調(diào)控

除了提高Cas9靶向的特異性及效率，實(shí)現(xiàn)Cas9活性的時(shí)空調(diào)控對(duì)于其應(yīng)用的拓展和安全性也十分重要。控制Cas9活性的時(shí)長(zhǎng)既有助于研究生命特定時(shí)間點(diǎn)的關(guān)鍵事件，也利于減少Cas9活性時(shí)間過(guò)長(zhǎng)所造成的脫靶突變及其他損害；而在空間層面的調(diào)控則有助于從器官、組織，甚或細(xì)胞群的層面開展更深入的研究。有研究表明將Cas9分裂成兩個(gè)片段，形成split-Cas9，通過(guò)雷帕霉素與其二聚化結(jié)構(gòu)域的結(jié)合可對(duì)其進(jìn)行化學(xué)誘導(dǎo)[21]，從而通過(guò)給藥控制Cas9活性的時(shí)長(zhǎng)?；趕plit-Cas9，衍生出光敏Cas9(photoactivatable Cas9, paCas9)，通過(guò)藍(lán)光輻射誘導(dǎo)paCas9二聚化功能域，實(shí)現(xiàn)對(duì)paCas9活性在時(shí)間和空間上的雙重調(diào)控[22]。

3 總結(jié)與展望

CRISPR/Cas9系統(tǒng)正在成為強(qiáng)有力的基因編輯工具。其優(yōu)勢(shì)在于快速、高效、適用范圍廣。將其應(yīng)用于各類真核系統(tǒng)，將有助于對(duì)細(xì)胞關(guān)鍵分子機(jī)制的理解，構(gòu)造疾病模型，以及藥物研發(fā)和基因治療的發(fā)展。

隨著相關(guān)研究的進(jìn)展，2類CRISPR-Cas系統(tǒng)及各種亞型的探索已有長(zhǎng)足進(jìn)展。除上述Ⅱ型Cas9系統(tǒng)，近期研究表明利用Cas12(前稱Cpf1或C2c1)的Ⅴ型系統(tǒng)及含有Cas13(前稱C2c2)的Ⅵ型系統(tǒng)[23]也可進(jìn)行基因編輯，且在某些情況下具有比Cas9更高的效率[24]。此外，近兩年還發(fā)展出了基于CRISPR系統(tǒng)的堿基編輯，利用胞嘧啶脫氨酶，通過(guò)誘導(dǎo)C->T轉(zhuǎn)變或胞嘧啶的多樣性改變實(shí)現(xiàn)特定堿基的編輯[25]，進(jìn)一步擴(kuò)展了CRISPR的應(yīng)用前景。

近年來(lái)關(guān)于靶向特異性與編輯效率的提高已進(jìn)展頗多，通過(guò)氨基酸殘基的突變改變Cas9構(gòu)象，以及利用NHEJ的修復(fù)策略進(jìn)行基因敲入等都為CRISPR/Cas9技術(shù)的優(yōu)化帶來(lái)了新的思路。但隨著該技術(shù)未來(lái)在臨床研究及治療中的應(yīng)用，這兩大關(guān)鍵問(wèn)題仍是關(guān)系到安全與效果的關(guān)鍵因素，值得引起研究者的注意，并開展更加深入的研究。相信隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的不斷革新和優(yōu)化，它將為功能生物學(xué)、生物技術(shù)和基因治療等各領(lǐng)域帶來(lái)新的契機(jī)。

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新聞點(diǎn)擊

“袋鼠育兒法”有助于提升早產(chǎn)兒的健康和智力

據(jù)英國(guó)《BBC新聞》(BBCNEWS)2016-12-12報(bào)道，一項(xiàng)新的研究發(fā)現(xiàn)，母親與新生嬰兒經(jīng)常肌膚相親，將可培育出更健康、聰明和成功的下一代。一項(xiàng)具有里程碑的試驗(yàn)在經(jīng)過(guò)20年的追蹤訪問(wèn)后發(fā)現(xiàn)，當(dāng)年用“袋鼠育兒法”培育的初生嬰兒，其智商測(cè)驗(yàn)的得分比對(duì)照組嬰兒多53%，而且不容易出現(xiàn)行為偏差，如侵略或缺勤的表現(xiàn)。

袋鼠育兒法，顧名思義就是仿效袋鼠媽媽的做法，在嬰兒出生后，盡快將嬰兒放在媽媽胸部的位置上。受過(guò)訓(xùn)練的媽媽以溫暖的胸部充當(dāng)嬰兒的保溫箱，給嬰兒肌膚相親提供了親密接觸的刺激和以母乳喂養(yǎng)的食物來(lái)源。這個(gè)方法經(jīng)常用于替代早產(chǎn)兒的保溫育嬰。

1993至1996年，研究人員以隨機(jī)選擇的方式分別將哥倫比亞超過(guò)700多名早產(chǎn)兒放在保溫箱中培育或使用“袋鼠育兒法”。

20年后，由加拿大政府資助的追蹤調(diào)查顯示，那些接受“袋鼠育兒法”的嬰兒相比之下受益較大。不僅早產(chǎn)兒的死亡率較低，只有3.5%(對(duì)照組的死亡率為7.7%)，而且智商測(cè)驗(yàn)也比對(duì)照組略微優(yōu)越3.5%，腦容量和灰質(zhì)也較多。

波哥大袋鼠基金會(huì)領(lǐng)導(dǎo)這項(xiàng)研究的契帕克(Nathalie Charpak)博士認(rèn)為這種方法經(jīng)過(guò)20年仍具有顯著、持久的社會(huì)和行為保障作用。

吸煙加上糖尿病是致命性的組合

據(jù)美國(guó)WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 03)報(bào)道，一項(xiàng)新研究證實(shí)，雖然吸煙對(duì)健康已經(jīng)非常有害，但加上糖尿病會(huì)讓早死的風(fēng)險(xiǎn)增加更多。研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)有糖尿病的吸煙者的早死風(fēng)險(xiǎn)比沒(méi)有血糖疾病的吸煙者多增加1倍。

紐約Montefiore醫(yī)學(xué)中心的臨床糖尿病中心主任Joel Zonszein博士認(rèn)為，吸煙對(duì)所有人都不好，但對(duì)于那些糖尿病患者更不好。

這篇研究發(fā)現(xiàn)，相較于沒(méi)有這種疾病的女性吸煙者來(lái)說(shuō)，有糖尿病的女性吸煙者死于肺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加了80%。

然而，在男性的身上并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這個(gè)趨勢(shì)。對(duì)男性來(lái)說(shuō)，有糖尿病與整體的早死風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，但并未發(fā)現(xiàn)與死于肺癌風(fēng)險(xiǎn)較高有關(guān)。

研究主導(dǎo)人員Kavita Garg博士指出，吸煙者不管有沒(méi)有篩檢肺癌，控制糖尿病都是很重要的，因?yàn)樘悄虿∈撬劳龅莫?dú)立風(fēng)險(xiǎn)因子。

吸煙對(duì)于糖尿病患者不利，它會(huì)使周邊動(dòng)脈阻塞性疾病(腿部循環(huán)不良)以及心臟病惡化，增加因肺癌死亡或因慢性阻塞性肺病(COPD)而殘疾的傾向。

戒煙能改善糖尿病患者的整體健康，讓他們?cè)诒苊馓悄虿〔l(fā)癥時(shí)更容易去運(yùn)動(dòng)并控制糖尿病。