趙麗華，位 嘉，槐英麗，張曉敬，張 超，林秋蘭，王克杰，閆紅燕，郭家良，李秋穎

(民航總醫(yī)院 病理科，北京 100123)

乳腺癌作為女性最常見的惡性腫瘤，尋找一種無創(chuàng)、敏感的方法監(jiān)測腫瘤進展情況，及時調(diào)整治療方案是目前治療中亟待解決的問題。

1896 年在一例因腫瘤死亡的患者外周血中發(fā)現(xiàn)了類似腫瘤細胞的細胞， 并提出循環(huán)腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)這一概念。 CTC 的定義為自發(fā)或因診治過程中導(dǎo)致原發(fā)病灶或轉(zhuǎn)移病灶播散進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞[1]。在外周血中約每106～107個白細胞中可能僅有1個CTC[2]。CTC檢測被看作液體活檢，對于腫瘤患者的預(yù)后判斷、療效評價以及個體化治療均有重要的指導(dǎo)作用[3]。

本研究應(yīng)用將FISH與免疫熒光抗體技術(shù)相結(jié)合，探討檢測乳腺癌腫瘤組織中JARID1B/KDM5B的表達是否可以作為患者腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)監(jiān)測的指標之一。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對象：收集2014—2016年民航總醫(yī)院術(shù)前37例影像學(xué)診斷可疑乳腺癌患者，患者年齡介于32～61歲，平均年齡43歲，經(jīng)知情同意告入選此課題，患者術(shù)前未做任何治療，于術(shù)前抽取5 mL外周靜脈血，應(yīng)用imFISH方法進行外周血液循環(huán)腫瘤細胞檢測，術(shù)中行冰凍病理檢查，其中35例患者確診為浸潤性乳腺癌，術(shù)后腫瘤標本進行免疫組化檢測腫瘤組織中組蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B的表達，該項目已通過民航總醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 試劑：鼠抗P16單抗和S-P免疫組化試劑盒(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；鼠抗JARID1B/KDM5B單抗(DAKO生物試劑公司)。

1.2 方法

1.2.1 病理診斷依據(jù)：所有病理切片由兩位副高級以上病理學(xué)專家依據(jù)2016版WHO標準診斷。

1.2.2 病理診斷標準：兩名醫(yī)師依據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO，2016版)的分類系統(tǒng)進行腫瘤組織分型及分級，所有患者根治性術(shù)后石蠟病理診斷為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌Ⅱ-Ⅲ級。

1.2.3 免疫組化S-P法檢測和結(jié)果判定：JARID1B/KDM5B陽性物質(zhì)定位于細胞核，JARID1B/KDM5B陽性細胞絕對值計數(shù)時注意選取陽性細胞高度密集的區(qū)域，并且取顯微鏡下4個高倍鏡視野的平均值。依據(jù)陽性細胞數(shù)：0級：≤10%；1級：10%～25%；2級：25%～50%；3級：50%～75%；4級：>75%。依據(jù)染色強度：1)弱陽性；2)中等強度陽性；3)強陽性。IHC最終得分：0：陰性(-)；1～4：弱陽性(+)；5～8：中等強度陽性(++)；9～12：強陽性(+++)。病理切片由兩名以上副主任醫(yī)師閱片，進行病例的篩選、分組及免疫組化等陽性結(jié)果的判定。

1.2.4 imFISH(免疫熒光原位雜交)法檢測:陰性富集：每例患者的采血抽取外周血至ACD抗凝管中，立即顛倒混勻8次,采用萊爾生物醫(yī)藥科技有限公司的陰性富集法對外周血3.2mL進行獲取CTC處理，具體操作如下：1)離心去除血漿蛋白：用CS1溶液將離心管內(nèi)液體體積分別補充至45 mL(650×g離心5 min)，去上清至12 mL；2)去除紅細胞：兩管分別加CS2溶液至45 mL。將離心管置于垂直混勻儀混勻，室溫8 min(650×g離心5 min)，棄上清至1～2 mL；3)去除白細胞：按每管100 μL的比例，將偶聯(lián)了抗人白細胞表面抗原單克隆抗體組合群的免疫磁微粒緩慢加入上述樣本中，固定于搖床上，室溫搖動20 min；4)涂片：最后經(jīng)離心、富集，去除上清液后，剩余100 μL細胞懸液，將細胞涂于特殊載玻片上，使用固定液CF1對標本固定，過夜干燥。

imFISH鑒別CTC:熒光原位雜交選用CEP8/CEP17兩種標志物(雅培)。標本脫水后，加入預(yù)混的CEP8/CEP17探針10 μL，蓋上蓋玻片，放入雜交儀(DAKO)，進行75 ℃變性5 min、雜交1.5 h。CD45免疫熒光染色1 h，滴加DAPI，封片。

在自動掃描及分析系統(tǒng)(Cyttel PathfinderTM系統(tǒng))下對標本區(qū)進行自動掃描及分析，CEP8/CEP17均以信號點≥3個為陽性，而滿足CEP8+/CD45-/DAPI+或CEP17+/CD45-/DAPI+的細胞視為陽性細胞。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS19.0(SPSS Inc. Chicago, IL, USA)軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，采用χ2檢驗Spearman’s等級相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

35例確診為乳腺浸潤性導(dǎo)管癌患者中CTC檢測陽性病例(CTC數(shù)目≥2)27例，陰性病例(CTC數(shù)目<2)8例，上述病例相對應(yīng)癌組織中的JARID1B/KDM5B免疫組化結(jié)果見表1，JARID1B/KDM5B的陽性表達強度與患者血液學(xué)患腫瘤細胞數(shù)(CTC)呈正相關(guān)(P<0.01)(圖1A～C)。

表1 KDM5B的表達與循環(huán)腫瘤細胞相關(guān)性的分析

rs=0.509,*P<0.01.

3 討論

通常把進入人體外周血的腫瘤細胞稱為CTC，迄今已有證據(jù)表明惡性腫瘤在早期就有癌細胞脫落進入到循環(huán)系統(tǒng)，這些脫落的癌細胞自原發(fā)灶脫落后進入到血循環(huán)，再穿透血管壁到繼發(fā)部位種植，但它們必須逃避機體的免疫監(jiān)測，并在多種因子作用下刺激腫瘤血管生成才可能形成轉(zhuǎn)移灶。血循環(huán)中檢測到CTC 并不意味著有遠處轉(zhuǎn)移，但轉(zhuǎn)移的概率會大大增加[4]。CTC檢測技術(shù)應(yīng)用于多種腫瘤的檢測中，對138例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者在治療前和治療后10周進行影像學(xué)評估，發(fā)現(xiàn)20例(14%)影像學(xué)進展且CTC<5的患者中位OS明顯長于22例(16%)影像學(xué)進展且CTC≥5的患者；影像學(xué)評價在2位影像科醫(yī)師之間的變異率為15.2%，而CTC在不同實驗室評價的變異率僅為0.7%。結(jié)果顯示CTC評估比現(xiàn)有影像學(xué)方法更早、重復(fù)性更好用于指示疾病情況[5]。在前瞻性、雙盲和多中心大型臨床研究中[6]，第一次證實了CTC檢測在中國轉(zhuǎn)移性乳腺癌中的應(yīng)用價值，研究證實CTC水平與轉(zhuǎn)移部位、激素受體狀態(tài)及HER- 2狀態(tài)相關(guān)，首次隨訪的CTC數(shù)目也可預(yù)測PFS及OS。CTC檢測作為標準的影像學(xué)檢查手段之外的輔助評估方法， 其優(yōu)勢在于能更早判斷疾病進展，為患者及時調(diào)整治療方案提供更多幫助。

A.invasive breast carcinoma HE high magnification； B.the strong expression of JARID1B/KDM5B in cancer tissues S-P method high magnification； C.CTC 7 imFISH high magnification

圖1乳腺癌組織學(xué)及循環(huán)腫瘤細胞
Fig1BreastcarcinomatissueandCTC(×200)

組蛋白去甲基化酶JARID1B/KDM5B最初是在乳腺癌中過度表達而分離得到的， JARID1B/KDM5B在乳腺癌中的表達與ER陽性具有很強的相關(guān)性，廣泛地表達在ER陽性的乳腺癌和乳腺癌細胞系，有研究證實JARID1B/KDM5B蛋白的陽性表達率與乳腺癌腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、R&B評分呈正相關(guān)性[7]。

本研究應(yīng)用imFISH方法初步證實聯(lián)合CTC的檢測及乳腺癌組織中JARID1B/KDM5B的表達，對判斷腫瘤復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移具有一定的預(yù)測價值，鑒于JARID1B/KDM5B在乳腺癌組織與正常組織中表達的差異性，JARID1B/KDM5B也可能會成為乳腺癌治療的一個新靶標。

[1] 孫鳳榮,馬德亮,張佃富,等. 早期乳腺癌患者手術(shù)對循環(huán)腫瘤細胞的影響[J].中國腫瘤臨床與康復(fù)，2016，23：1284- 1286.

[2] Tibbe AG, Miller MC, Terstappen LW. Statistical considerations for enumeration of circulating tumor cells [J].Cytometry A, 2007, 71: 154- 162.

[3] Nadal R, Lorente JA, Rosell R,etal. Relevance of molecular characterization of circulating tumor cells in breast cancer in the era of targeted therapies[J]. Expert Rev Mol Diagn, 2013, 13: 295- 307.

[4] Powell AA, Talasaz AH, Zhang Hetal.Single cell profiling of circulating tumor cells: transcriptional heterogeneity and diversity from breast cancer cell lines[J]. PLoS One, 2012, 7: e33788. doi:10.1371/journal.pone.0033788.

[5] Budd GT, Cristofanilli M, Ellis MJ,etal. Circulating tumor cells versus imaging-predicting overall survival in metastatic breast cancer[J].Clinic Cancer Res, 2006, 12: 6403- 6409.

[6] 李蕾,江澤飛.循環(huán)腫瘤細胞檢測在不同階段不同類型乳腺癌中的應(yīng)用循環(huán)腫瘤細胞檢測在不同階段不同類型乳腺癌中的應(yīng)用 [J].中國癌癥雜志，2013，23：570- 575.

[7] Zhao LH, Liu HG. Immunohistochemical detection and clinicopathological significance of JARID1B/KDM5B and P16 expression ininvasive ductal carcinoma of the breast[J]. Genet Mol Res,2015, 14: 5417- 5426.

新聞點擊

孤獨會降低乳腺癌幸存率

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2016- 12- 19)報道，最新研究指出，孤獨可能會降低乳腺癌幸存率。

研究人員發(fā)現(xiàn)，在治療幾年后，相較于愛交朋友或支持網(wǎng)絡(luò)的女性來說，那些沒有強烈社會關(guān)系的女性比較容易癌癥復(fù)發(fā)或死亡。

研究人員評估了近10 000萬名乳癌患者的資料后發(fā)現(xiàn)，相較于與喜歡社交的女性來說，孤立的女性癌癥復(fù)發(fā)的風(fēng)險增加40%。

美國癌癥協(xié)會的主任Kassandra Alcaraz認為，人是社交性動物，從與他人的關(guān)系中獲益，成為群落中的一部分并不令人意外。我們知道社交關(guān)系對健康來說很重要。

但這一結(jié)果并不代表孤獨的人注定會早死，也不是說孤獨與幸存率差有因果關(guān)系。

這篇報告刊登在2016- 12- 19的《癌癥》中。